מאמר שיטה

ציטומטריית זרימה כמותית לחקר אינטראקציות שלפוחית חלבון-פוספוליפידים

8 ביולי 2025

במאמר זה

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מקור: Podoplelova, N. et al., ניתוח האינטראקציה של חלבונים בעלי תווית פלואורסצנטית עם מיקרופוליפידים מלאכותיים באמצעות ציטומטריית זרימה כמותית. J. Vis. Exp. (2022)

בסרטון זה אנו מדגימים את האינטראקציה בין חלבונים לבין שלפוחיות פוספוליפידים מלאכותיות באמצעות ציטומטריית זרימה כמותית. קשירת חלבונים המסומנים בפלואורסצנטיות לשלפוחיות פוספוליפידים המסומנים בפלואורסצנטיות מגבירה את עוצמת הפלואורסצנטיות הממוצעת, ועלייה זו מזוהה על ידי ציטומטר זרימה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. זיהוי אינטראקציה חלבון-שומנים על ידי ציטומטריית זרימה

  1. ניסויי קשירה קינטית
    1. בועיות פוספוליפידים מדוללות במאגר של Tyrode (20 mM HEPES, 150 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 1 mM MgCl2, 0.4 mM NaH2PO4, 2.5 mM CaCl2, 5 mM גלוקוז, 0.5% BSA, pH 7.4) לריכוז של 1 μM ונפח כולל של 250 μL.
    2. יש לערבב את גורם הקרישה X (fX-fd) בשלב 1 בריכוז של 500 ננומטר עם שלפוחיות הפוספוליפידים משלב 1.1.1 ביחס של 1:1 (ריכוז שלפוחית סופית 0.5 מיקרומטר, ריכוז fX-fd הוא 250 ננומטר של fX) לנפח כולל של 500 מיקרוליטר.
    3. הזריקו מיד את 500 μL של המתלה המעורב (~ 20 דקות לניתוח עם קצב זרימה נמוך) לתוך ציטומטר הזרימה. השתמש בקצב זרימה נמוך וודא שהסף עבור ערוץ FL2 (עירור 488 ננומטר, מסנן פליטה 585/42 ננומטר) הוא בערך 200. מדוד את הפלואורסצנטיות הממוצעת בתעלה FL4 (עירור 633 ננומטר, מסנן פליטה 660/20) עבור הצבע הפלואורסצנטי מטבלת החומרים.
      הערה: בחר ציטומטר ללא דוגם אוטומטי. זה יאיץ את תהליך הזרקת הדגימה לתא המדידה.
    4. כאשר מושגת רוויה של קשירה (אין עלייה משמעותית בפלואורסצנטיות תוך 5 דקות), מדללים במהירות את הדגימה פי 20 עם החיץ של טירוד, ומפקחים על הדיסוציאציה עד שמגיעים לפלואורסצנטיות הבסיסית (דיסוציאציה מלאה) או עד שמגיעים לרמה (אין ירידה משמעותית בפלואורסצנטיות תוך 5 דקות).
      הערה: כבקרה, הוסף 10 μM EDTA ונטר ניתוק מלא למשך 5 דקות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
לא הוכרז על ניגוד עניינים.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)תרמו פישר סיינטיפיקA37573צבע פלואורסצנטי
BD FACSCantoIIBD Bioscience
DiIC16(3) (1,1'-Dihexadecyl-3,3,3',3'-Tetramethylindocarbocyanine Perchlorate)תרמו פישר סיינטיפיקD384צבע פלואורסצנטי
DMSOסיגמא אולדריץ'D8418
HEPESסיגמא אולדריץ'H4034-500G
L-α-פוספטידיל-סרין (מוח, חזיר) (מלח נתרן)אוונטי פולאר ליפידים840032P
L-α-פוספטידילכולין (מוח, חזיר)אוונטי פולאר ליפידים840053P
מיני אקסטרודראוונטי פולאר ליפידים610020-1EA
אשלגן כלוריסיגמא אולדריץ'P9541-500G
סידן כלורי, נטול מים, אבקה, ≥97%סיגמא אולדריץ'C4901-100G
נתרן פוספט מונובייסיקסיגמא אולדריץ'S3139-250G
נתרן כלוריסיגמא אולדריץ'S3014-500G
מגנזיום כלוריסיגמא אולדריץ'M8266-100G
אלבומין בסרום בקרVWR מדעי החיים אמרסקוAM-O332-0.1
מלח דיסודיום EDTAVWR מדעי החיים אמרסקוAm-O105B-0.1

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Tyrode

מאמרים קשורים