הערה: יש לסנן את המאגרים באמצעות מסנן של 0.22 מיקרומטר ולנטרל אותם באמצעות ואקום למשך שעה אחת.
1. הכנת שלפוחית שומנים
- השתמש צינורות זכוכית 2-mL. יש להמיס כל שומנים, 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC), 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC), 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine (POPS) וכולסטרול (Chol), בתערובת של כלורופורם/מתנול (50:50 v/v) להכנת תמיסת שומנים שקופה של 5 mM. יש להמיס 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-myo-inositol-4',5'-bisphosphate) (PI(4,5)P2) בתערובת של כלורופורם/מתנול/מים (20:9:1 v/v).
- שלב את השומנים המומסים ביחס המולרי הרצוי של POPC/POPS (80/20), POPC/PI(4,5)P2 (95/5), POPC/POPS/Chol (60/20/20), POPC/POPS/PI(4,5)P2/Chol (60/17/3/20), ו-POPC/DOPC/POPS/PI(4,5)P2/Chol (37/20/20/3/20) (טבלה 1) בצינורות זכוכית 10-mL.
הערה: הסכום הסופי של סך השומנים הוא 500 מיקרוגרם.
- אידוי הממסים האורגניים באמצעות זרם יבש של חנקן. השאירו את תערובת השומנים על מערכת ואקום גבוהה (ליופיליזציה) למשך 3 שעות כדי להסיר עקבות שיוריים של הממסים.
הערה: התוצאה היא סרט יבש ושקוף.
- השהה מחדש את סרט השומנים ב 1 מ"ל של חיץ ציטראט (10 mM trisodium-ציטראט, 150 mM NaCl, pH 4.6). לדגור על תרחיף השומנים ב 60 ° C (טמפרטורה זו היא סביב 10 ° C מעל טמפרטורת מעבר הפאזה של השומנים הנמסים הגבוהה ביותר בתערובת) במשך 30 דקות באמבט מים, ולערבל אותו במרץ כל 5 דקות.
הערה: התוצאה היא היווצרות שלפוחיות גדולות ורב-למלריות (MLV). שמור את המתלים מעל טמפרטורת המעבר.
- מחממים מראש את המכבש (ב 60 ° C במקרה זה) מצויד קרום פוליקרבונט בגודל נקבוביות בקוטר 50 ננומטר מעל טמפרטורת המעבר (שהיא 40 - 50 ° C כאן) למשך 30 דקות.
- העמיסו את מתלה ה-MLV לתוך המכבש שחומם מראש והעבירו בעדינות את התערובת 31x דרך קרום הפוליקרבונט ליצירת שלפוחיות חד-למלריות קטנות (SUV). שמור על הטמפרטורה מעל טמפרטורת המעבר.
- העבר את מתלי SUV לכלי תגובה פלסטי של 2 מ"ל והוסף את חיץ הציטראט (ראה שלב 1.4) כדי להביא את הנפח הסופי ל- 2 mL.
הערה: זה יניב ריכוז שומנים סופי של 250 מיקרוגרם / מ"ל.
2. טיפול בחיישני הקוורץ
הערה: טפל תמיד בחיישני הקוורץ באמצעות טוויטר.
- יש לדגור על ארבעה חיישנים המוחדרים למחזיק פוליטטרה-פלואוראתילן בתמיסת SDS 2% למשך ≥-30 דקות. שטפו אותם בהרחבה במים טהורים במיוחד כדי להסיר לחלוטין את ה-SDS ולתת להם להתייבש באמצעות זרם של ארגון יבש או חנקן.
- השתמש במערכת ניקוי פלזמה כדי להסיר לחלוטין את כל המזהמים. הכניסו את החיישנים היבשים לתא ניקוי הפלזמה, פנו את החדר ושטפו אותו פי 3 בחמצן. הפעל את שואב הפלזמה. השתמש בפרמטרי התהליך הבאים: לחץ Torr של 1 x 10-4, הספק תדר רדיו גבוה (RF) ו- 10 דקות של זמן תהליך. כבו את המכונה והוציאו את החיישנים.
3. פעולת מיקרו-איזון
הערה: נעשה שימוש במערכת מיקרו-איזון עם ארבעה תאי זרימה מבוקרי טמפרטורה בתצורה מקבילית, המחוברים למשאבה פריסטלטית ומוגדרים לקצב זרימה של 80 מיקרוליטר/דקה. במצב זרימה פתוחה, המאגר נשאב ממאגר ההזנה למיכל הקליטה. במצב לולאה, מיכל הקבלה היה מחובר למאגר ההזנה כדי ליצור לולאה סגורה. הטמפרטורה נקבעה ל -20 מעלות צלזיוס.
- עגנו בזהירות את החיישנים המנוקים בפלזמה לתוך 4 תאי הזרימה, באמצעות פינצטה. הימנע מכל לחץ או פיתול של החדרים והצינורות שעלולים לגרום לדליפה.
- שטפו את המערכת במאגר ציטראט (10 mM trisodium-citrate, 150 mM NaCl, pH 4.6) במצב זרימה פתוחה למשך 10 דקות.
הערה: זה דורש בדיוק 3.2 מ"ל של חיץ, אבל מומלץ להשתמש חיץ עודף (10 מ"ל).
- הפעל את התוכנית. התחל להקליט שינויים בתדירות ובפיזור של הטון הבסיסי הראשון (n = 1st) וצלילים עיליים (n = 3rd - 13th) באמצעות התוכנה, עד שקווי הבסיס של התדר והפיזור יציבים (זה ייקח בערך 40 - 60 דקות).
הערה: רמות רעש התדר (משיא לשיא) צריכות להיות נמוכות מ-0.5 הרץ, ועבור הפיזור, נמוכות מ-0.1·10-6, עם סחף מקסימלי (בתמיסה מימית) של 1 הרץ/שעה בתדר ו-0.3.10-6/שעה בפיזור.
- כאשר קווי הבסיס יציבים, יש להפעיל את מתלי SUV בחיץ ציטראט (2 מ"ל בצינור קטן). באמצעות כלי תגובה, להסיר 1.5 מ"ל של נפח מת. לאחר מכן סגור את המערכת במצב זרימת לולאה. הקלט את שינוי התדר/פיזור למשך 10 דקות נוספות.
הערה: במהלך הזמן הזה, השלפוחיות יתפשטו על פני השטח של SiO2 ויתמזגו ליצירת דו-שכבה רציפה (שלב 2 באיורים 1, איור 2 ואיור 3). ספיחת רכבי השטח על פני החיישן היא דו-פאזית ויש לה מינימום ומקסימום תדרים אופייניים בפיזור. קו בסיס יציב חדש של תדר/פיזור תדר עם שינוי תדרים אופייני (בהתאם להרכב השומנים) בין 26 ל-29 הרץ (ראה טבלה 1) מציין דו-שכבה רציפה על פני השטח.
- כאשר ה-SLB יציב (ראה שלב 3.4), אזנו את המערכת עם מאגר הריצה (10 mM HEPES, 150 mM NaCl, pH 7.4) בריכוזי Ca2+ הנדרשים (החל מ-50 מיקרומטר ועד 1 מילימטר CaCl2, בהתאם לניסוי) במצב זרימה פתוחה למשך 40 דקות.
- הוסף את החלבון (כאן, AnxA2) למאגר הריצה המכיל Ca2+ (ראה שלב 3.5). בצעו את היישום של החלבון במצב זרימה לולאתית עד שמגיעים למצב יציב של שיווי משקל (שלב 3 באיור 1, איור 2 ואיור 3).
הערה: ריכוז החלבון עשוי לנוע בין 1 ל-400 ננומטר. ספיחת חלבונים גורמת לשינוי תדר תלוי ריכוז המשקף את ספיחת המסה (חלבון).
- נתקו את החלבון הכבול על-ידי כלאט יוני Ca2+ עם 5 mM EGTA במאגר הריצה במצב זרימה פתוחה (שלב 4 באיורים 1 ובאיור 2).
הערה: התאוששות של התדירות והפיזור לקו הבסיס של SLB מצביעה על הפיכות מוחלטת של קשירת החלבון. ניתן לחזור על מחזורי אסוציאציה-דיסוציאציה כדי להשוות ריכוזים או חלבונים שונים.
