$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. הדמיה של היווצרות עיבוי EWS-FLI1 על וילונות DNA
- פתח את תוכנת ההדמיה, מצא וסמן את המיקומים של 3 × 3 תבניות זיג-זג מתחת לשדה הבהיר.
- הפעל את הזרימה במהירות של 0.2 מ"ל/דקה כדי להכתים את הדנ"א בצבע הדנ"א הדו-גדילי למשך 10 דקות.
- לדלל mCherry-EWS-FLI1 עם חיץ הדמיה לריכוז של 100 ננומטר ב 100 μL בצינור.
- טען את דגימת החלבון דרך השסתום עם מזרק זכוכית 100 μL, ושנה את קצב הזרימה ל 0.4 מ"ל / דקה.
- הפעל את הלייזר של 488 ננומטר וסרוק מראש כל אזור כדי לבדוק את מצב התפלגות הדנ"א; בחר את האזור שבו מולקולות הדנ"א מתפזרות באופן שווה. הגדר את עוצמת הלייזר ל- 10% עבור לייזר 488 ננומטר ו- 20% עבור לייזר 561 ננומטר. השתמש במד הכוח כדי למדוד את עוצמת הלייזר האמיתית ליד המנסרה: 4.5 mW עבור לייזר 488 ננומטר ו- 16.0 mW עבור לייזר 561 ננומטר.
- רכישת תמונות
- התחל לקבל תמונות במרווחי זמן של 2 שניות עם לייזרים של 488 ננומטר ולייזר של 561 ננומטר בו-זמנית.
- שנה את השסתום ממצב ידני למצב הזרקה כדי לאפשר למאגר ההדמיה לשטוף את דגימת החלבון לתוך תא הזרימה לאחר 60 s.
הערה: תהליך זה ייקח ~30 שניות, ושדה הראייה יכוסה באותות mCherry ברגע שהחלבונים EWS-FLI1 יגיעו לתא הזרימה.
- כדי להסיר את EWS-FLI1 החופשי, המשך לשטוף את תא הזרימה באמצעות מאגר ההדמיה למשך 5 דקות כאשר רק מדפסת הלייזר של 561 ננומטר מופעלת. עצור את הזרימה ודגור ב 37 ° C למשך 10 דקות.
- הפעל את הזרימה במהירות של 0.4 מ"ל/דקה כדי לאפשר לדנ"א להתרחב, וקבל תמונות במרווחים של 2 שניות בין מסגרות שונות כדי לקבל נתוני תפוקה גבוהה של היווצרות עיבוי EWS-FLI1.
2. ניתוח עוצמה עבור mCherry-EWS-FLI1
- ייבאו את הנתונים כרצפי תמונות לתוכנת ImageJ, בחרו את הפונקטה ב-25× אתרי GGAA בריבוע של 8×8 פיקסלים ושמרו את התמונה בפורמט .tif.
- חשב את העוצמה כסיכום העוצמה בריבוע של 8×8 פיקסלים, כולל כל הנקב, והסר את הרקע על-ידי הפחתת עוצמת הרקע באזור באותו גודל ליד ריבוע 8x8 פיקסלים.