בדיקת אפנון pH על שכבות שומנים נתמכות לזיהוי אינטראקציות חלבון-פוספואינסיטיד

תקציר

מקור: Shengjuler, D., et al., PIP-on-a-chip: A Label-free Study of Protein-phosphoinositide Interactions. J. Vis. Exp. (2017)

בסרטון זה, אנו מדגימים אינטראקציות חלבון-פוספואינסיטיד בתבנית מיקרופלואידית באמצעות בדיקת אפנון pH, באמצעות צבע פלואורסצנטי רגיש ל-pH המתויג לשומנים פוספטידיל-אתנולמין של דו-שכבה ליפידית נתמכת, הנקראת פלטפורמה מיקרופלואידית. המודולציות ב- pH לאחר קשירת חלבון לפוספוליפידים גורמות למרווה פלואורסצנטית.

פרוטוקול

1. יצירת דו-שכבות שומנים נתמכות (SLBs)

1. העבר 100 μL של רכבי שטח המכילים PI(4,5)P2 לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה 0.65 מ"ל. התאם את ה- pH של התמיסה ל~ 3.2 על ידי הוספת 6.4 μL של 0.2 N חומצה הידרוכלורית.
   הערה: אשר את ה- pH של התמיסה עם מד pH מצויד בבדיקת מיקרו pH (ראה טבלת חומרים).
2. פיפטה 10 μL של תמיסת SUV מותאמת pH לכל תעלה דרך הכניסה ולהפעיל לחץ דרך פיפטה עד שהתמיסה מגיעה לשקע. נתקו את הקצה מהפיפטה והשאירו אותו מחובר למכשיר.
3. חזור על השלב לעיל עבור כל ערוץ ולאחר מכן דגור על המכשיר למשך 10 דקות ב- RT.
   הערה: הזרקת שלפוחיות לתוך microchannels צריך להתבצע מיד לאחר הרכבת המכשיר.
4. חתכו סטים של צינורות כניסה ויציאה באורך 60 ס"מ (צינורות כניסה) ו-8 ס"מ (צינורות יציאה), בהתאמה.
   הערה: חיתוך הצינור באלכסון ויצירת קצה חד, מקל על הכנסת הצינור לפתחים ולשקעים. צינורות היציאה צריכים להיות בצורת קשת. אורך צינורות הכניסה עשוי להשתנות בהתאם למערך המיקרוסקופ. הקוטר הפנימי של הצינור הוא 0.05 ס"מ.
5. באמצעות פינצטה, חבר את מערכת צינורות השקע למכשיר ולאחר מכן הדביק את המכשיר על במת מיקרוסקופ.
6. שקעו בקצה אחד של צינור הכניסה שנקבע ב-25 מ"ל של חיץ ריצה הכלול בצינור חרוטי והדביקו אותו כדי לוודא שהצינור מאובטח.
7. מקם את הצינור החרוטי על קרקע גבוהה יותר (~ 20 ס"מ) מהמכשיר על מנת לדחוף את התמיסה דרך המיקרו-ערוצים באמצעות זרימת הכבידה; ניתן להשתמש בשקע מעבדה כדי להשיג זאת.
8. עבור כל צינור כניסה, השתמש מזרק כדי לצייר 1 מ"ל של חיץ פועל מהקצה החופשי של הצינור. הסר את קצה פיפטה מהכניסה והכנס את הקצה החופשי של צינור הכניסה למכשיר.
   הערה: הכניסו טיפה של חיץ רץ לכניסה כדי להפחית את ההסתברות להחדרת בועת אוויר לתעלה במהלך שלב זה. לאחר חיבור צינור הכניסה למכשיר, השתמש במגבון ללא סיבים כדי להסיר את המאגר העודף.
9. חזור על השלב לעיל כדי לחבר את כל צינורות הכניסה למכשיר.
   הערה: חיץ זורם זורם דרך התעלות מסייע להסיר בועיות עודפות ולאזן את הדו-שכבה לתנאי ניסוי.
10. פתח את תוכנת בקרת המיקרוסקופ (ראה טבלת חומרים). בחלונית השמאלית, לחץ על הכרטיסייה "מיקרוסקופ" ובחר את המטרה "10X".
11. לחץ על "Live" ולאחר מכן "Alexa 568" סמלי תמונה בסרגל הכלים. באמצעות ידיות הכוונון העדינות והמסלוליות, התמקדו במיקרו-ערוצים.
12. סרוק דרך המכשיר כדי לבדוק את איכות ה-SLB והערוצים (איור 1). לאחר מכן, לחץ על סמל התמונה "FL Shutter Closed" בסרגל הכלים.
13. לחץ על הכרטיסייה "רכישה", ותחת "התאמות בסיסיות" בחר "זמן חשיפה". הגדר את זמן החשיפה ל "200 אלפיות השנייה".
14. בחלונית השמאלית, לחץ על "רכישה רב מימדית" ותחת תפריט המסננים בחר את הערוץ האדום (מסומן כ- "Alexa 568"). לאחר מכן, לחץ על תפריט "קיטועי זמן", הגדר את מרווח הזמן ל -5 דקות, משך הזמן ל -30 דקות ולחץ על "התחל".
    הערה: בהתבסס על משך הזמן (30 דקות) וקצב הזרימה (~ 1.0 μL / min), 30 μL של מאגר ריצה משמש כדי לאזן את SLB בתוך ערוץ, כלומר 240 μL של מאגר פועל משמש עבור כל 8 הערוצים.
15. בחר בכלי "מעגל" תחת הכרטיסייה "מדידה" וצייר מעגל בכל ערוץ. לחץ לחיצה ימנית בזמן בחירת העיגול ובחר "מאפיינים". תחת הכרטיסייה "פרופיל", סמן את "כל T" כדי להציג את עוצמת הפלואורסצנטיות כפונקציה של זמן.
    1. ודא שעקומה זו מגיעה לרמה, המציינת שיווי משקל, לפני שתמשיך לשלב הבא.
16. הנמיכו את תמיסת החיץ להארקה שווה כמו המכשיר לעצירת הזרימה.
17. שמור את קובץ קיטועי הזמן.

2. בדיקת אינטראקציית תחום PH PLC-δ1 עם SLBs המכילים PI(4,5)P2

1. הכן דילולים של תחום PH באמצעות המאגר הפועל כמדלל.
   הערה: מכיוון שיש שמונה ערוצים בתוך המכשיר, השתמש לפחות בשניים מהם עבור פקדים ריקים. בחרו את הקצוות הרחוקים מכל צד והשתמשו בתעלות הנותרות לדילול חלבונים. נבדקו ריכוזי תחום ה-PH הבאים: 0.10, 0.25, 0.50, 1.00 ו-2.50 מיקרומטר. כ-200 מיקרוליטר מכל דילול הספיקו כדי להגיע לשיווי משקל תוך 30 דקות.
2. אחד בכל פעם, נתקו כל צינור מוצא ומרחו 200 μL מכל דילול חלבון לתוך תעלת היציאה באמצעות פיפטה. אל תפעיל שום לחץ, תן לכוח הכבידה לעשות את העבודה. נתקו את הקצה מהפיפטה והשאירו אותו מחובר למכשיר המיקרופלואידי.
3. חזור על השלב לעיל עבור כל ערוץ וודא כי בועות אוויר אינן מוכנסות לתוך הערוצים במהלך תהליך זה.
4. הורידו את צינור הכניסה לקרקע מתחת למכשיר המיקרופלואידי כדי להתחיל להזרים את החלבון דרך המיקרו-תעלות. הדביקו את הקצה החופשי של הצינור למיכל פסולת. מזרימים את דילולי החלבונים במשך 30 דקות.
   הערה: זה יהפוך את הזרימה ויאפשר להכניס את החלבון לתעלות. הזמן לשיווי משקל ונפח דילול החלבונים הדרוש יהיה תלוי בזיקה של האינטראקציה.
5. בחלונית השמאלית של התוכנה, תחת הכרטיסייה "Time Lapse", לחץ על "התחל" כדי להתחיל בהדמיה שוב.
6. לאחר השלמת הניסוי, שמור את קובץ קיטועי הזמן.

תוצאות

איור 1: הערכת התקינות של SLB ומיקרו-ערוצים. (A) תמונה הממחישה SLB ומיקרו-ערוצים באיכות גבוהה. (B) מיזוג חלקי. (C) מיקרו-ערוצים מאוחים. (D) חלקיק אבק הכלוא בתוך מיקרו-ערוץ. (E) בועות אוויר הכלואות בתוך מיקרו-ערוצים.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
1-פלמיטויל-2-אולויל-SN-גליצרו-3-פוספוכולין	אוונטי פולאר ליפידים	850457ג	POPC
L-α-פוספטידילינוזיטול-4-פוספט	אוונטי פולאר ליפידים	840045X	PI4P
L-α-פוספטידילינוזיטול-4,5-ביספוספט	אוונטי פולאר ליפידים	840046X	PI(4,5)P2
1-פלמיטויל-2-אולויל-SN-גליצרו-3-פוספואתנולמין	אוונטי פולאר ליפידים	850757ג	אפיפיור; נדרש לסינתזה של oSRB-POPE
ליסמין רודאמין B סולפוניל כלוריד (איזומרים מעורבים)	תרמופישר סיינטיפיק	L-20	נדרש לסינתזה של oSRB-POPE
בדיקת שומנים פלואורסצנטיים רגישים ל- pH (oSRB-POPE)	בתוך הבית	לא ישים	סינתזה פנימית (Huang D. et al. 2013)
מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי אקסיוברט 200M	קרל זיס מיקרוסקופיה	לא ישים	מיקרוסקופ
מצלמת AxioCam MRm	קרל זיס מיקרוסקופיה	לא ישים	מצלמה
X-Cite 120	אקסליטס טכנולוגיות	לא ישים	מקור אור
ערכת מסננים Alexa 568	קרל זיס מיקרוסקופיה	לא ישים	Ex/Em 576/603 נאנומטר
AxioVision LE64 v.4.9.1.0 תוכנה	קרל זיס מיקרוסקופיה	לא ישים	תוכנה לעיבוד תמונה
טיפים	VWR	10034-132	200 uL פיפטה קצוות; קצה דק וחלק למריחת תמיסת החלבון בתעלה המיקרופלואידית
טיפים	VWR	53509-070	10 uL פיפטה קצוות; קצה דק וחלק למריחת תמיסת השלפוחית לתוך התעלה המיקרופלואידית
כוכב אוריון A321 pH מטר	תרמו סיינטיפיק	STARA3210	מד pH
בדיקת מיקרו pH אוריון	תרמו סיינטיפיק	8220BNWP	בדיקת מיקרו pH
N-(2-הידרוקסיאתיל)-פיפרזין-N'-(2-חומצה אתנסולפונית)	VWR	VWRB30487	HEPES, חומצה חופשית
נתרן כלורי	VWR	BDH8014-2.5KGR	NaCl
אבובים	חוט וכבל של Allied	TFT-200-24 N	קוטר פנימי: 0.020-0.026 אינץ' (0.051-0.066 ס"מ); עובי קיר: 0.010 אינץ' (0.025 ס"מ); צינורות קיר דקים גמישים Polytetrafluoroethylene ; צבע טבעי
גז חנקן - תעשייתי	פרקסאייר	לא ישים	ספק מקומי
גז חמצן - תעשייתי	פרקסאייר	לא ישים	ספק מקומי
חנקן נוזלי	פרקסאייר	לא ישים	ספק מקומי