ספקטרוסקופיית NMR כמותית של מימן בתוך התא לניטור אינטראקציות חלבון-ליגנד

תקציר

מקור: Barbieri, L. et al., ניטור אינטראקציות חלבון-ליגנד בתאים אנושיים על ידי NMR כמותי בזמן אמת בתוך התא באמצעות ביוריאקטור בצפיפות תאים גבוהה.J. Vis. Exp.(2021)

בסרטון זה, אנו מדגימים את טכניקת ספקטרוסקופיית התהודה המגנטית הגרעינית בתוך התא כדי לחקור אינטראקציות חלבון-ליגנד בין חלבונים לא מסומנים בעלי ביטוי יתר לבין מולקולות קטנות. האינטראקציה המוצלחת בין ליגנד לחלבון מאושרת חזותית על ידי הופעתה של קבוצה נוספת של פסגות באזור העניין הספקטרלי שמחליפה בהדרגה את הפסגות המקוריות.

פרוטוקול

1. מגיב והגדרת פתרון

1. להכנת DMEM מלא, יש להוסיף 5 מ"ל L-גלוטמין 200 מ"ל, 5 מ"ל פניצילין-סטרפטומיצין 100x וסרום בקר עוברי 50 מ"ל (FBS, ריכוז סופי של 10% vol/vol) ל-440 מ"ל DMEM.
   הערה: פתרון זה ניתן לאחסן ב 4 °C למשך חודש אחד.
2. הכינו תמיסת אגרוז על ידי המסת 150 מ"ג של אגרוז דל ג'ל ב-10 מ"ל של מלח חוצץ פוספט (PBS) ב-85°C כדי לקבל תמיסת 1.5% (w/v). יש לעקר באמצעות סינון עם מסנן של 0.22 מיקרומטר. הכן 1 מ"ל aliquots של פתרון agarose ב 1.5 N
3. הכינו את מדיום הביוריאקטור.
   1. ממיס 13.4 גרם אבקת DMEM ב-1 ליטר טהור במיוחד H₂O.
      הערה: בהתאם ליישום, הנפח הסופי הנדרש עשוי להשתנות (למשל, עבור 500 מ"ל בינוני, להמיס 6.7 גרם אבקה ב 500 מ"ל H₂O).
   2. הוסף 2% FBS, 10 mM NaHCO₃, 1x פניצילין-סטרפטומיצין (100x) ו- 2% D₂O (למשל, עבור 500 מ"ל בינוני, הוסף 10 מ"ל של FBS, 0.4 גרם של NaHCO₃, 5 מ"ל של פניצילין-סטרפטומיצין 100x, ו- 10 מ"ל של D₂O).
   3. מדוד את ה- pH באמצעות מד pH ובמידת הצורך התאם ל- 7.4 על ידי הוספת HCl.
      הערה: בדרך כלל, ה- pH הראשוני קרוב מאוד ל -7.4.
   4. סנן את מדיום הביוריאקטור עם מסנן סטרילי מונע ואקום בבקבוק זכוכית סטרילי של 250 מ"ל או 500 מ"ל
   .
   5. במכסה המנוע של הזרימה הלמינרית, אטמו את הבקבוק עם כיסוי ראש סטרילי מפלדה עם שני חרירי צינור וחברו אותם לצינור FEP (o.d. = 1/8", i.d. = 1.6 מ"מ) שיחובר למשאבה ולמסנן מזרק PTFE 0.22 מיקרומטר לכניסת אוויר.

2. הגדרת ביוריאקטור

1. הרכיבו את יחידת הזרימה באמצעות צינור NMR של יחידת זרימה שנייה, אשר יוחלף מאוחר יותר בצינור המכיל את התאים. עיין בהוראות ההפעלה של יחידת הזרימה עבור ההרכבה הנכונה.
   הערה: בשלב זה, יש לנקות כבר את יחידת הזרימה (אם לא, בצע את שלב 4.2).
2. הגדר את אמבט המים המחובר לבקרת הטמפרטורה של יחידת הזרימה ל -37 מעלות צלזיוס. הניחו את בקבוק המאגר באמבט המים.
3. חבר את צינור ה- FEP של בקבוק המאגר למשאבה.
4. סובב את שסתום הביוריאקטור כדי "לעקוף" ומלא מראש את המשאבה בתווך.
5. סובב את שסתום הביוריאקטור כדי "לזרום" ומלא מראש את הביוריאקטור בתווך במהירות של 0.1 מ"ל/דקה.

3. הכנת דגימת התא

1. לאסוף את התאים מאינקובטור CO₂.
   1. קח בקבוק T75 של תאי HEK293T נגועים מאינקובטור CO₂ והסר את המדיום המשומש.
   2. לשטוף את התאים פעמיים עם 7 מ"ל (כל אחד) של PBS בטמפרטורת החדר (~ 20 ° C).
   3. השתמש 2 מ"ל של טריפסין/EDTA כדי לנתק תאים. לאחר הוספת התמיסה, יש לדגור במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר כדי לנתק את התאים.
      הערה: תאים נגועים עשויים לקחת מעט יותר זמן כדי להתנתק. במידת הצורך, לדגור על התאים ב 37 ° C.
   4. להשבית טריפסין עם 20 מ"ל של DMEM מלא; ביסודיות להשעות את התאים על ידי pipetting למעלה ולמטה ולהעביר אותם בצינור צנטריפוגה 50 מ"ל.
   5. צנטריפוגו את התאים ב 800 x גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר ולזרוק את supernatant.
   6. לשטוף את התאים עם 10 מ"ל של PBS בטמפרטורת החדר כדי להסיר את המדיום שיורית.
   7. צנטריפוגו את התאים ב 800 x גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר ולזרוק את supernatant.
   8. מעבירים את גלולת התא לצינור מיקרוצנטריפוגה בנפח 1.5 מ"ל.
2. הטמע תאים בחוטי אגרוז.
   1. להמיס aliquot אחד של agarose מוצק ב 85 ° C באמבט מים ולאחר מכן לשמור אותו בתמיסה ב 37 ° C בתנור בלוקים.
   2. בעזרת פיפטת פסטר, ממלאים את תחתית צינור ה-NMR של יחידת הזרימה ב-60-70 מיקרוליטר של ג'ל אגרוז 1.5% ומניחים אותו בקרח. פעולה זו תיצור תקע תחתון גבוה ~ 5 מ"מ המאפשר למקם את דגימת התא בתוך הנפח הפעיל של סליל 1 H NMR.
   3. חממו את גלולת התאים המתקבלת בשלב 3.1.8 בטמפרטורה של 37°C למשך 15-20 שניות בתרמובלוק.
   4. תאי השעיה מחדש ב 450 μL של תמיסת אגרוז. היזהר למנוע היווצרות של בועות.
   5. שאפו את מתלה התא-אגרוז לתוך כרומטוגרפיה באורך ~30 ס"מ צינור PEEK (i.d. = 0.75 מ"מ) מחובר מזרק 1 מ"ל.
      הערה: לפני השאיפה, הצינור ואת הנפח המת של המזרק צריך להיות מלא מראש עם PBS בטמפרטורת החדר כדי למנוע היווצרות של בועות. אורך הצינור אינו קריטי.
   6. תנו לצינורות להתקרר בטמפרטורת החדר למשך 2 דקות.
   7. מלאו מראש את צינור ה-NMR של יחידת הזרימה ב-100 מיקרוליטר PBS בטמפרטורת החדר.
   8. יצקו חוטים של תאים המשובצים באגרוז לתוך צינור NMR של יחידת הזרימה על ידי דחיפה עדינה של המזרק.
      הערה: כדי למלא את צינור ה-NMR בצורה הומוגנית, התחל בהצבת קצה צינור ה-PEEK בתחתית צינור ה-NMR והמשך לכיוון החלק העליון תוך כדי נדנוד איטי שמאלה-ימין.
   9. חזור על שלבים 3.2.5, 3.2.6 ו- 3.2.8 עד שכל ההשעיה התאית יצוקה.
3. הכנס תאים לביוריאקטור.
   1. הסר את צינור ה- NMR הריק מיחידת הזרימה והגדל את קצב הזרימה ל- 2 מ"ל / דקה למשך מספר דקות כדי להסיר בועות גז שיוריות בצינורות הכניסה.
   2. הגדר את קצב הזרימה ל- 0.2 מ"ל לדקה והכנס את צינור ה- NMR המכיל את התאים על ידי דחיפתו כלפי מעלה לאט אך בהתמדה.
      הערה: הזרימה הפעילה של התווך מונעת את הזרימה חזרה של תוכן הצינור דרך הכניסה שאחרת הייתה מתרחשת במהלך ההחדרה.

4. תפעול וניקוי ביוריאקטור

1. פעולת ביוריאקטור במהלך ניסוי NMR.
   1. הגדר את הטמפרטורה בספקטרומטר NMR ל- 310 K.
   2. הכנס את יחידת הזרימה לספקטרומטר.
   3. ספק את התווך הביוריאקטור בקצב זרימה של 0.1 מ"ל/דקה למשך כל ניסויי ה-NMR בתוך התא.
   4. בזמן הרצוי במהלך הניסוי, מזריקים תמיסה מרוכזת של המולקולה החיצונית לבקבוק המאגר הבינוני על ידי פירסינג צינור הסיליקון במזרק סטרילי בעל מחט ארוכה.
      הערה: יש לבחור את הריכוז הסופי של המולקולה בתווך על סמך ידע קודם על רעילות התא, ואם קיים, על קצב הדיפוזיה החזוי/משוער דרך קרום התא.
   5. בתום ניסוי ה-NMR, החליפו את הצינור המכיל את התאים בצינור ריק ושטפו את יחידת הזרימה במים.
2. ביוריאקטור נקי במקום.
   1. נקו את יחידת הזרימה על ידי הזרמת התמיסות הבאות במהירות של 1 מ"ל/דקה: 0.2 מ' נתרן הידרוקסידי (NaOH); 3 מ' חומצת לימון; 0.2 מ' NaOH, למשך 30 דקות לפחות כל אחת, ולאחר מכן מים אולטרה-טהורים מסוננים סטריליים למשך >2 שעות.
   2. נקו ובצעו אוטוקלאבים של בקבוק המאגר ומכלול הצינורות לאחר כל ריצה.

5. ניסויי NMR

1. הקמת ניסויי NMR.
   הערה: בצע שלבים אלה לפני כן, לפני הכנת דגימת ה- NMR בתוך התא, כדי למנוע עיכובים בין איסוף התאים לרכישת הנתונים.
   1. צור מערך נתונים חדש בספקטרומטר NMR והגדר את הפרמטרים עבור ניסויי ה- NMR הרצויים.
   2. הגדר פרמטרים עבור ניסויי 1D ¹H NMR.
   3. מרכז את תדר המוביל של ¹H ב- 4.7 עמודים לדקה באות המים.
   4. בחר את תוכנית הדופק zgesgp, הגדר את הרוחב הספקטרלי ל- 20 ppm, ופולס מרובע של 1,000 μs 180° לדיכוי מים. הגדר השהיה בין סריקות של 1 שניות. רכוש את הספקטרום עם 32 סריקות.
   5. עבור תאים המבטאים CA II ללא תווית: בחר בתוכנית הדופק p3919gp, הגדר את הרוחב הספקטרלי ל- 30 ppm כדי לכסות את אזור האימינו של הספקטרום, והתאם את ההשהיה לדיכוי מים בינומי כך שהעירור המרבי יתרכז בשינויים הכימיים של אותות העניין (d7 = 20 μs ב- 950 MHz). הגדר השהיה בין סריקה של ≥1 שניות. רכישה עם 512 סריקות.
   6. עבור תאים המבטאים ¹⁵N-labeled SOD1: בחר את תוכנית הדופק sfhmqf3gpph, הגדר את הרוחב הספקטרלי של ¹H ו- ¹⁵N ל- 16 ו- 50 ppm, בהתאמה, היסט הפולס המעוצב ורוחב פס העירור ל- 8.5 ו- 6 ppm, בהתאמה, ופולס של 350 μs לסכמת ניתוק (garp4 או אחר בהתאם למכשיר). הגדר השהיה בין סריקות של 0.3 שניות. רכוש 16 סריקות ו-128 דרגות בממד ¹⁵N.
2. רכישת ספקטרום NMR בזמן אמת.
   1. לאחר החדרת הביוריאקטור לספקטרומטר NMR, המתינו מספר דקות כדי לאפשר את החלפת התווך.
      הערה: תהליך זה מנוטר בקלות מהופעת אות הנעילה כאשר PBS מוחלף בתווך המכיל 2% D₂O.
   2. כוונן את ההתאמה והכוונון של ערוץ ¹H, שים את המגנט וחשב את אורך הפולס הקשיח של ¹H 90°.
   3. התאם את רמות ההספק של ¹H בכל רצף פולסים בהתאם לפולס הקשיח של ¹H.
   4. הקלט ספקטרום zgesgp ¹H ראשון כדי לבדוק את תוכן הדגימה ואת הומוגניות השדה.
   5. העתק את הניסויים zgesgp ו- p3919gp/sfhmqcf3gpph למספר הרצוי והצב אותם בתור במנגנון ההדפסה ברקע.
      כא: ספקטרום zgesgp משמש רק כדי לשלוט במצב הדגימה ואת הומוגניות השדה; לכן, ניתן לדלג עליהם או להקליט אותם בתדירות נמוכה יותר.
   6. עבור תאים המבטאים CA II ללא תווית: עבד את ספקטרום p3919gp על-ידי החלת מילוי אפס ופונקציית חלון הרחבת קו מעריכי (LB = 20 הרץ).
   7. עבור תאים המבטאים ¹⁵N-labeled SOD1: עבד את ספקטרום sfhmqcf3gpph על-ידי החלת מילוי אפס ופונקציית חלון פעמון סינוס בריבוע (SSB = 2) בשני הממדים.
      הערה: ניתן להקטין עוד יותר את גודל הספקטרום המעובד על ידי הסרת אזורים ללא אותות (ב- Topspin, הדבר נעשה על ידי הגדרת ערכי STSR ו- STSI הרצויים).

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
חומרים
חומצת לימון	סיגמא-אולדריץ'	251275
D2O	סיגמא-אולדריץ'	453366
DMEM, גלוקוז גבוה	לייף טכנולוגיות	10313-021
DMEM, גלוקוז גבוה, אבקה	סיגמא-אולדריץ'	D5648
פ.ב.ס.	לייף טכנולוגיות	10270
HCl	סיגמא-אולדריץ'	30721
ל-גלוטמין (200 מילימול)	לייף טכנולוגיות	25030
אגרוז ג'ל נמוך, אבקה	סיגמא-אולדריץ'	A4018
NaHCO3, אבקה	קרלו ארבה	478537
PBS	לייף טכנולוגיות	10010
פניצילין-סטרפטומיצין (10,000 U/ml)	לייף טכנולוגיות	15140-122
כדורי NaOH	סיגמא-אולדריץ'	30620
טריפסין-EDTA (0.05% (wt/vol))	לייף טכנולוגיות	25300-054
ציוד
ספקטרומטר Avance III מצויד ב- CryoProbe 5 מ"מ	ברוקר	לא ישים	כל הספקטרומטרים המודרניים והמגנטים הצרים המצוידים בבדיקות 5 מ"מ תואמים.
יחידת זרימה InsightMR	ברוקר	לא ישים
מודול משאבת P-920 מבית ÄKTA FPLC	GE שירותי בריאות	לא ישים	כל משאבת FPLC, HPLC פריסטלטית או מזרק צריכה להיות תואמת ליחידת הזרימה.