$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
הערה: להלן השלבים לבדיקת פאגים T7 המזהים תרופות באמצעות חיישן ביולוגי QCM ושחזור הפאגים המוקרנים באמצעות זיהום E. coli (BLT5615). את הפרוטוקולים לסינתזה של נגזרת של מולקולה קטנה היוצרת חד-שכבה בהרכבה עצמית (SAM) ולבניית ספריית הפפטידים האקראיים T7 המוצגת בפאגים 15-mer ניתן למצוא במקומות אחרים.
1. הכנת שבב חיישן QCM
- חבר שבב חיישן קרמי על המתנד של מכשיר QCM 27-MHz, ורשום את התדר הפנימי (Hz) בשלב האוויר לפני אימוביליזציה של מולקולות קטנות.
- נתק את השבב ושחרר 20 μL של תמיסה (1 mM ב 70% אתנול) של נגזרת מולקולה קטנה היוצרת SAM על אלקטרודת הזהב של שבב החיישן באמצעות פיפטה.
זהירות: גביש שבב החיישן שבו ממוקמת אלקטרודת הזהב (Au, 0.1 מ"מ עובי, 2.5 מ"מ i.d., 4.9 מ"מ2) הוא דק ביותר ועלול להיסדק בקלות (SiO2, 0.06 מ"מ עובי, 9 מ"מ i.d). לפיכך, פיפטה בזהירות.
- השאירו למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר (סביב 20 מעלות צלזיוס) בצלחת פטרי עם טישו לח ומוגן מפני אורות החדר.
- שטפו את משטח האלקטרודה בעדינות במים טהורים במיוחד; לאחר מכן, הסירו את טיפות המים על ידי נשיפת אוויר עם מזרק או דוסטר אוויר.
- הגדר את שבב החיישן עבור מנגנון QCM ורשום את הפחתת התדר בפאזה האווירית כדי למדוד את כמות המולקולה הקטנה שהושתקה.
הערה: לפחות, 100 הרץ של תדר פנימי נחוצים לאימוביליזציה מוצלחת של מולקולות קטנות (1 הרץ משתק 30 pg).
2. ביו-פאנינג של ספריית הפאגים T7 באמצעות חיישן ביולוגי QCM (איור 1)
- הניחו קובטה עם מערבל מגנטי ייעודי על החיישן הביולוגי QCM ושפכו 8 מ"ל של מאגר התגובה (10 mM Tris-HCl, 200 mM NaCl, pH 7-8) לתוך הקובט.
- חבר את שבב חיישן QCM למתנד ומשוך מטה את זרוע המתנד כדי לטבול את השבב במאגר המעורבב במהירות 1000 סל"ד.
- התחל לנטר את תדר ה- QCM במחשב האישי (PC) והמתן עד שהחיישן יתאזן לכ- 3 הרץ לדקה של סחף התדר.
- הזריקו 8 μL של ספריית פאגים T7 (1—2 × 1010 pfu/mL) לתוך הקובטה (ריכוז סופי: 1—2 × 107 pfu/mL) וסמנו את נקודת ההזרקה על החיישן.
- עקוב אחר הפחתת התדרים הנגרמת על ידי קשירה של פאגים T7 למולקולה הקטנה המשותקת על פני אלקטרודת הזהב במשך 10 דקות.
- עצור את צג תדר QCM, נתק את שבב החיישן מהמתנד והסר את המאגר על-ידי ניפוח אוויר ו/או פתילה באמצעות מגבונים.
- הכנס את שבב החיישן לצלחת פטרי לחה ושחרר את 20 μL של התרחיף של E. coli (BLT5615) (OD600 = 0.5—1.0 לאחר טלטול ב 37 ° C על ידי הוספת IPTG ל 1 mM) תאים מארחים בשלב log על אלקטרודת הזהב.
- סגרו את מכסה התבשיל וכסו אותו ברדיד אלומיניום כדי לחסום את האור.
- לדגור את המנה ב 37 ° C במשך 30 דקות על מיקסר 96 באר microplate (1000-1500 סל"ד) לשיפור ההתאוששות של פאגים T7 כרוך.
- לשחזר את 20 μL של הפתרון ולהשעות אותו לתוך 200 μL של LB medium.
הערה: הדגימות המתקבלות בשלב זה ניתן לשמר ב 4 ° C במשך שבוע אחד.
- הכינו סדרת דילול של תמיסת הפאגים לבידוד פלאק וריצוף DNA בהתאם לנוהל הכללי המתואר בהוראות היצרן.
