כרומטוגרפיה של אי הכללת גודל עם פיזור אור רב-זוויתי עבור אוליגומרים חלבונים

תקציר

מקור: Some, D. et al., אפיון חלבונים על ידי כרומטוגרפיה של אי הכללת גודל המצומדים לפיזור אור רב-זוויתי (SEC-MALS). J. Vis. Exp. (2019).

סרטון וידאו זה מתאר את SEC-MALS, הממנף את היכולות של כרומטוגרפיה של אי-הכללת גודל (SEC) ופיזור אור רב-זוויתי (MALS). ב-SEC-MALS, ה-SEC מפריד חלבונים או קומפלקסים חלבוניים בהתבסס על גודלם, וגלאי MALS קובע את המשקל המולקולרי הממוצע על ידי מדידת עוצמת האור המפוזר על ידי המולקולה בזוויות שונות.

פרוטוקול

1. הכנת המערכת

1. חבר את גלאי ה- MALS וה- dRI במורד הזרם של גלאי ה- UV של ה- FPLC. עקוף את גלאי ה- pH והמוליכות מכיוון שהם יוסיפו נפח בין-גלאי משמעותי בין גלאי UV וגלאי MALS. השתמש בצינורות נימים של 0.25 מ"מ i.d. מהעמוד אל הגלאים וביניהם, וצינורות נימים i.d. 0.75 מ"מ על פלט הגלאים לפסולת או לאיסוף שברים.
2. ודא כי חיבורי האות הדרושים בין ה- FPLC לגלאים נוצרו, כולל פלט אנלוגי מגלאי UV לקלט האנלוגי MALS, ופלט דיגיטלי מה- FPLC ל- MALS Autoinject, באמצעות תיבת הקלט/פלט של ה- FPLC.
3. התקן עמודת SEC אנליטית מתאימה המכסה טווח שברים של לפחות 20 kDa עד 500 kDa. בדוק את פרטי המוצר כדי לקבוע אם העמודה מתאימה לטווח של MW, pH ומאפיינים אחרים של שלב הדגימה והנייד.

2. הכנת חיץ, שטיפת המערכת למשך הלילה ובדיקת ניקיון

1. באמצעות ריאגנטים ברמת HPLC, להכין 1 ליטר של מלוחים חוצצים פוספט עם 50-100 mM NaCl. סנן את המאגר ל- 0.1 מיקרומטר באמצעות מסנן סולפון פוליאתר עליון או דומה. סננו את 50-100 מ"ל החיץ הראשונים לבקבוק פסולת והשליכו, על מנת לסלק חלקיקים מהמסננים היבשים, ולאחר מכן סננו את השאר לבקבוק נקי וסטרילי שנשטף ביסודיות במים מסוננים, דה-מיוננים ומכוסה כדי למנוע כניסת אבק.
   הערה: ניתן להשתמש בממיסי פאזה ניידים אחרים כגון חיץ Tris אם יש לנתח חלבונים נוספים המומסים באופן מועדף בממסים אלה.
2. יש לשטוף למשך הלילה בקצב זרימה של 0.5 מ"ל/דקה, או לפי המלצת יצרן העמודה, כדי לאזן את העמוד במאגר ולהסיר חלקיקים. השתמש במצב זרימה רציפה של FPLC וודא שהזרימה אינה נפסקת עד להשלמת כל הפעלות SEC-MALS.
   1. מקם את תא זרימת ה-dRI במצב טיהור במהלך שטיפת הלילה. כבה את הטיהור לפני תחילת ריצות הדגימה.
   2. בעת תחילת השטיפה, הגבירו בהדרגה את קצב הזרימה כדי למנוע את אפקט "שפיכת העמודות" (או שחרור חלקיקים) הנגרם על ידי שינוי פתאומי של הלחץ בעמודה.
   3. אם ידוע שהמערכת יציבה למדי ונטולת חלקיקים, ובשיווי משקל עם הפאזה הניידת הרצויה, החליפו את סומק הלילה בשטיפה קצרה יותר, 2-3 שעות.
3. בדוק את ניקיון המערכת על ידי הקשה קלה על הצינור במורד הזרם של העמוד כדי לשחרר חלקיקים שהצטברו והתבוננות באות בגלאי 90° בתצוגת הלוח הקדמי של מכשיר ה- MALS. ודא שהרעש משיא לשיא אינו עולה על 50 -100 μV.
4. בצע הזרקה 'ריקה' כדי לוודא שהמזרק נקי מחלקיקים. 'ריק' הוא פשוט חיץ הריצה, המוכן בבקבוקון טרי וסטרילי.
   1. אם שיא החלקיקים הוא לא יותר מ 1 מ"ל נפח ולא יותר מ 5 mV מעל קו הבסיס, אז המערכת מוכנה דגימות. אחרת, בצע הזרקות ריקות נוספות עד לניקוי, או בצע תחזוקה כדי לנקות את המזרק.

3. הכנת הדגימה והעמסתה

1. הכן לפחות 200 μL של BSA ב 1-2 מ"ג / מ"ל במאגר SEC.
   הערה: על מנת למנוע משקעים, BSA לא צריך להיות מומס במים טהורים.
2. סננו את החלבון ל-0.02 מיקרומטר באמצעות מסנן חוד מזרק.
3. השליכו את טיפות התסנין הראשונות על מנת לסלק חלקיקים מהמסננים היבשים.
4. לחלופין, צנטריפוגו את הדגימה במהירות של 10,000 x גרם למשך 15 דקות כדי לאפשר משקעים של אגרגטים לא מסיסים וחלקיקים גדולים אחרים.
5. הזריקו 100 μL של תמיסת BSA לתוך הלולאה.
   הערה: זוהי כמות החומר המומלצת, וניתן להזריק פחות או יותר בהתאם לנסיבות הדגימה כגון יציבות או זמינות. כמות החלבון הנדרשת לכל זריקה משתנה ביחס הפוך עם משקל מולקולרי כפול מזה של מסת חלבון אם המשקל המולקולרי הוא 33 kDa או מחצית מזה של BSA.

4. הכנת תוכנת MALS

1. פתח חדש | נסה משיטה בתפריט התוכנה MALS ובחר בשיטה Online מהתיקיה שיטות מערכת פיזור אור. אם קיים גלאי DLS, בחר בשיטה Online מתוך פיזור האור | עם תיקיית QELS.
2. בקטע תצורה, הגדר את הפרמטרים של שלב המדגם והנייד.
   1. בתצוגת משאבה כללית, הגדר את קצב הזרימה לזה המשמש ב- FPLC.
   2. בתצוגה משאבה כללית, ענף ממס, שדה שם, בחר PBS.
   3. בתצוגה מזרק, ענף דגימה, הזן את השם כ- BSA והגדר dn/dc = 0.185 (הערך הסטנדרטי עבור חלבונים שלא השתנו), A2 = 0 ומקדם הכחדת UV = 0.667 mL/(mg-cm).
      הערה: עבור חלבונים אחרים, מקדם ההכחדה UV₂₈₀ ננומטר עשוי להימצא בספרות או מחושב על פי הרצף שלו באמצעות כלי תוכנה שונים לרשות הציבור.
3. במקטע הליכים, תצוגת איסוף בסיסי, בחר בתיבת הסימון Trigger on Autoinject והגדר את משך הריצה ל- 70 דקות כך שהנתונים ייאספו עבור ההזרקה כולה עד שנפח החדירה הכולל של עמודת SEC יגיע ל- .
   הערה: משך הזמן הדרוש עשוי להשתנות בהתאם לעמודה ולקצב הזרימה - 35 דקות מהאוסף נדרשות עבור עמודת HPLC-SEC סטנדרטית של 7.8 מ"מ x 300 מ"מ ב- 0.5 מ"ל לדקה.
4. התחל את הניסוי בתוכנת MALS על ידי לחיצה על כפתור הפעלה. הוא יתחיל לקרוא את הנתונים לאחר קבלת אות הדופק ממכשיר ה- FPLC באמצעות גלאי MALS.
5. אפס את אות ה- dRI על-ידי לחיצה על הלחצן Autozero בלוח הקדמי של המכשיר.

5. הכנת תוכנת FPLC

1. הכנס את שם החלבון ואת ההפעלה לתוכנת FPLC, במדריך | ביצוע הוראות ידניות | הגדר סימן.
2. העברת שסתום ההזרקה מעומס ידני להזרקה תחת נתיב זרימה | שסתום הזרקה.
3. כלול אות פולס על-ידי הכנסת פולס של 0.5 שניות מתחת לתיבת הקלט/פלט | פולס דיגיטלי החוצה. פעולה זו תפעיל איסוף נתונים בתוכנת MALS.

6. הזריקו את הדגימה לתוך הלולאה. לחץ על בצע בתוכנת FPLC כדי להתחיל את הפעלת הניסוי.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
AKTA טהור	GE שירותי בריאות	29-0182-26	כרומטוגרף נוזלי חלבון מהיר (FPLC)
AKTA חד קרן	GE שירותי בריאות		תוכנת בקרת FPLC
אסטרה	טכנולוגיית Wyatt		תוכנה לאיסוף וניתוח נתוני MALS
אלבומין בסרום בקר (טוהר>97%)	סיגמא	A1900	אנליט
שחר או מיני שחר	טכנולוגיית Wyatt	WH2 או WTREOS	WH2 או WTREOS
הגדל 200 10/300	GE שירותי בריאות		עמוד אי הכללת גודל, 200 Å נקבוביות, 10 מ"מ תעודת זהות, אורך 300 מ"מ
OptiLab	טכנולוגיית Wyatt	WTREX	גלאי אינדקס שבירה דיפרנציאלי (RI)
נתרן כלורי NaCl	סיגמא	71382	NaCl ברמת HPLC
בקבוק Stericup מסנן עליון פוליאתר סולפון 0.1 מיקרומטר 1000 מ"ל	מיליפור	מיליפור	מסנן פאזה ניידת
Whatman Anotop 10 מסנן מזרק 0.02 מיקרומטר	GE שירותי בריאות	6809-1002	המסנן 'דוגמה'
מסנן קצה מזרק Whatman Anotop 10, נקבוביות 0.1 מיקרומטר, קוטר G 10 מ"מ	GE שירותי בריאות	6809-1012	המסנן 'דוגמה'
Whatman Anotop 25 מסנן מזרק 0.1 מיקרומטר	GE שירותי בריאות	6809-2012	מסנן פאזה ניידת
WyattQELS	טכנולוגיית Wyatt	וויק	גלאי פיזור אור דינמי