טיהור זיקה דו-מולקולרית לבידוד שני חלבונים המקיימים אינטראקציה

תקציר

מקור: Hastings, J. F. et al. Dissecting Multi-protein Signaling Complexes by Bimolecular Complementation Affinity Purification (BiCAP). J. Vis. Exp. (2018)

בסרטון זה, הדגמנו טיהור זיקה דו-מולקולרית, BiCAP, כדי לזהות ולבודד דימרים חלבוניים ספציפיים באמצעות נוגדנים ספציפיים ספציפיים לתחום יחיד.

פרוטוקול

1. תרבית תאים וטרנספקציה

הערה: עבור טרנספקציה של וקטורי BiFC חשוב להשיג יעילות גבוהה וטרנספקציה הומוגנית יחסית. סביר להניח שהווקטורים יהיו תואמים לכל מגיב טרנספקציה סטנדרטי, ויש למטב את תנאי הטרנספקציה בהתאם. כדי לבצע ספקטרומטריית מסות, אנו בדרך כלל מגדלים תאים בתוך כלים של 10 ס"מ, אם כי ניתן גם להקטין זאת באופן יחסי לכלים קטנים יותר או לצלחות קטנות יותר עבור ניסויים הדורשים פחות חומר.

1. זרע 1.0 × 10⁶ HEK293T תאים בצלחת 10 ס"מ עם 10 מ"ל של מדיה DMEM, בתוספת 10% FBS ופניצילין / סטרפטומיצין (1: 100).
2. לדלל 2.5 מיקרוגרם מכל וקטור BiFC לתוך 500 μL של חיץ טרנספקציה (ראה טבלה של חומרים) בצינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מ"ל.
3. הוסף 10 μL של מגיב transfection (ראה טבלה של חומרים).
4. תערובת מערבולת במשך 10 שניות, ולאחר מכן צנטריפוגה קצרה. יש לדגור במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
5. מוסיפים את תערובת הטרנספקציה של הדנ"א לצלחת, טיפתית. לדגור על התאים למשך זמן מספיק עבור חלבוני ההיתוך BiFC לקיים אינטראקציה ועבור קיפול ונוס והבשלה פלואורופורית, בדרך כלל ~ 8 - 24 h.
   הערה: שיא העירור של נוגה הוא 515 ננומטר, ושיא הפליטה שלו הוא 528 ננומטר, אם כי ניתן לצפות בכך בקלות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי סטנדרטי שהוקם כדי להמחיש פלואורסצנטיות GFP.

2. הכנת דוגמאות

1. קציר ליזטים
   1. לפני איסוף הליזט, הכינו את Cell Lysis Buffer [50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% (v/v) חומר ניקוי לא יוני (ראו טבלת חומרים)]. יש לאחסן בטמפרטורה של 4°C.
   2. מיד לפני הקציר, יש להוסיף 10 מ"ל של חוצץ ליזה של תאים עם מעכב פרוטאז ומעכב פוספטאז (ראו טבלת חומרים). יש לשמור את מאגר הליזה התאית על קרח.
   3. יש לשטוף תאים פעמיים ב-PBS קר כקרח. שאפו את PBS והוסיפו 1 מ"ל של מאגר תאים ליזה קר כקרח. הניחו את התבשיל על קרח, וודאו שהחיץ מפוזר על פני כל שטח הפנים.
   4. יש לדגור על קרח במשך כ-5 דקות, ולאחר מכן להשתמש במגרד תאים (ראו טבלת חומרים) כדי לגרד את התאים ולהעבירם לצינור מיקרוצנטריפוגה מקורר מראש בנפח 1.5 מ"ל.
   5. הסר פסולת תאית על ידי צנטריפוגה של הליזט שנאסף ב 18,000 × גרם למשך 5 דקות ב 4 ° C ולהעביר supernatant מפונה לתוך צינורות microcentrifuge טריים.
      הערה: בשלב זה, הליזט יכול לשמש מיד, או מאוחסן ב -80 ° C. מומלץ גם לשמור על aliquot של ליזט גולמי, כך יעילות של transfection וטיהור זיקה ניתן לאמת.
2. טיהור אהדה
   הערה: שלב הבידוד של BiCAP מתבצע באמצעות ננוני GFP מצומדים לחרוזי אגרוז (ראו טבלת חומרים).
   1. הכינו את חרוזי האגרוז על ידי שטיפת נפח מתאים (20 מיקרוליטר לדגימה + עודף 10 מיקרוליטר) ב 1 מ"ל PBS. צנטריפוגו את החרוזים ב 300 x גרם ולהסיר את supernatant.
   2. הוסף 20 μL לכל דגימת ליזט.
   3. לדגור על הדגימות במשך 2 שעות ב 4 ° C עם סיבוב מקצה לקצה.
      הערה: בשלב זה, הדגימות יכולות להיות מוכנות עבור SDS-PAGE ו blotting המערבי, או ניתוח על ידי ספקטרומטריית מסה.
3. הכנת BiCAP eluent לכתמים מערביים.
   1. צנטריפוגו את החרוזים ב 300 x גרם ושטפו אותם שלוש פעמים במאגר התא ליזיס.
   2. השהה מחדש את החרוזים השטופים ב- 50 μL של מאגר דגימה מדולל כראוי (ראה טבלת חומרים) וחמם את הדגימות ב- 95 ° C למשך 2-3 דקות.
      הערה: דגימות שהוכנו באופן זה ניתן לאחסן ב -20 ° C במשך מספר חודשים.
   3. בצע SDS-PAGE וניקוי מערבי הן עבור תג V1 והן עבור תגי V2 (ראה טבלת חומרים), כמו גם עבור חלבונים מעניינים אחרים.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
DMEM	גיבקו	11995-073	תרבית תאים
פ.ב.ס.	לייף טכנולוגיות אוסטרליה	10099-141	תרבית תאים
פניצילין/סטרפטומיצין	לייף טכנולוגיות אוסטרליה	15070-063	תרבית תאים
מאגר טרנספקציה jetPRIME	פוליפלוס	114-15	תרבית תאים
מגיב טרנספקציה jetPRIME	פוליפלוס	114-15	תרבית תאים
PhosSTOP (מעכב פוספטאז)	סיגמא-אולדריץ'	4906837001	תרבית תאים
קוקטייל מעכבי פרוטאז שלם, מיני ללא EDTA	רוש	11873580001	כלי פלסטיק
מגרד תאים	זארשטדט	83.1832
GFP-Trap_A	Chromotek Gmbh	GTA-100	GFP nanobody מוצמד לחרוזי אגרוז
N-terminal GFP נוגדן חד שבטי	קובנס	MMS-118P	יזהה את התג V1 בתוך וקטורי BiFC
C-terminal GFP נוגדן חד שבטי	רוש	11814460001	יזהה את התג V2 בתוך וקטורי BiFC
מאגר לדוגמה	Invitrogen	NP0008	בתוספת 1 מ"ל β-מרקפטואתנול.
טריפסין מעובד בדרגת ריצוף	חברת Promega	V5117h	תרבית תאים
צינורות מיקרוצנטריפוגות LoBind	אבחון נקודת טיפול	0030 108 116	כלי פלסטיק
יודואצטמיד	סיגמא-אולדריץ'	I1149-5G	מוכן במינון 5 מ"ג/מ"ל במים טהורים במיוחד
LTQ Orbitrap Velos Pro	תרמו פישר
תאי DH5α	תרמו פישר		תאים בעלי יכולת הלם חום