Method Article

טיהור זיקה דו-מולקולרית לבידוד שני חלבונים המקיימים אינטראקציה

July 8th, 2025

In This Article

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מקור: Hastings, J. F. et al. Dissecting Multi-protein Signaling Complexes by Bimolecular Complementation Affinity Purification (BiCAP). J. Vis. Exp. (2018)

בסרטון זה, הדגמנו טיהור זיקה דו-מולקולרית, BiCAP, כדי לזהות ולבודד דימרים חלבוניים ספציפיים באמצעות נוגדנים ספציפיים ספציפיים לתחום יחיד.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. תרבית תאים וטרנספקציה

הערה: עבור טרנספקציה של וקטורי BiFC חשוב להשיג יעילות גבוהה וטרנספקציה הומוגנית יחסית. סביר להניח שהווקטורים יהיו תואמים לכל מגיב טרנספקציה סטנדרטי, ויש למטב את תנאי הטרנספקציה בהתאם. כדי לבצע ספקטרומטריית מסות, אנו בדרך כלל מגדלים תאים בתוך כלים של 10 ס"מ, אם כי ניתן גם להקטין זאת באופן יחסי לכלים קטנים יותר או לצלחות קטנות יותר עבור ניסויים הדורשים פחות חומר.

  1. זרע 1.0 × 106 HEK293T תאים בצלחת 10 ס"מ עם 10 מ"ל של מדיה DMEM, בתוספת 10% FBS ופניצילין / סטרפטומיצין (1: 100).
  2. לדלל 2.5 מיקרוגרם מכל וקטור BiFC לתוך 500 μL של חיץ טרנספקציה (ראה טבלה....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
לא הוכרז על ניגוד עניינים.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
DMEMגיבקו11995-073תרבית תאים
פ.ב.ס.לייף טכנולוגיות אוסטרליה10099-141תרבית תאים
פניצילין/סטרפטומיציןלייף טכנולוגיות אוסטרליה15070-063תרבית תאים
מאגר טרנספקציה jetPRIMEפוליפלוס114-15תרבית תאים
מגיב טרנספקציה jetPRIMEפוליפלוס114-15תרבית תאים
PhosSTOP (מעכב פוספטאז)סיגמא-אולדריץ'4906837001תרבית תאים
קוקטייל מעכבי פרוטאז שלם, מיני ללא EDTAרוש11873580001כלי פלסטיק
מגרד תאיםזארשטדט83.1832
GFP-Trap_AChromotek GmbhGTA-100GFP nanobody מוצמד לחרוזי אגרוז
N-terminal GFP נוגדן חד שבטיקובנסMMS-118Pיזהה את התג V1 בתוך וקטורי BiFC
C-terminal GFP נוגדן חד שבטירוש11814460001יזהה את התג V2 בתוך וקטורי BiFC
מאגר לדוגמהInvitrogenNP0008בתוספת 1 מ"ל β-מרקפטואתנול.
טריפסין מעובד בדרגת ריצוףחברת PromegaV5117hתרבית תאים
צינורות מיקרוצנטריפוגות LoBindאבחון נקודת טיפול0030 108 116כלי פלסטיק
יודואצטמידסיגמא-אולדריץ'I1149-5Gמוכן במינון 5 מ"ג/מ"ל במים טהורים במיוחד
LTQ Orbitrap Velos Proתרמו פישר
תאי DH5αתרמו פישרתאים בעלי יכולת הלם חום

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Bimolecular ComplementationAffinity PurificationProtein Interaction DetectionFluorescence MicroscopyAgarose BeadsWestern BlottingSDS PAGECell LysisTransfection ReagentHEK293T Cells

Related Articles