1. הכנת דוגמאות
- לטהר את הביומולקולה הרצויה.
הערה: פרוטוקול זה משתמש באפטמר DNA MN4 קושר קוקאין שנרכש לאחר החלפה כנגד 2 M NaCl שלוש פעמים ולאחר מכן שלושה סבבים של מים דה-יוניים באמצעות מסנן צנטריפוגלי עם קרום חיתוך משקל מולקולרי של 3 kDa .
- לסנתז ולטהר, או לרכוש את ליגנד thermolabile הרצוי.
הערה: MN4 קושר את הליגנד התרמולאביל קוקאין. MN4 גם קושר כינין, המשמש כבקרה שלילית על תרמוליות ליגנד בטמפרטורות ניסוי אלה.
- הכינו מאגרים לדיאליזה של ביומולקולה מטוהרת ולהמסת ליגנדות (20 מילימטר נתרן פוספט ו-140 מילימטר מאגר NaCl, pH 7.4, עבור MN4 והליגנדות המשמשות כאן).
- דיאליזה של הביומולקולה כנגד לפחות 2 ליטר של החיץ באמצעות צינורות דיאליזה עם חיתוך של 0.5 - 1.0 kDa .
- סנן את המאגר הסופי (המכונה מאגר העבודה) דרך מסנן של 0.2 מיקרומטר שאוזן היטב עם המאגר.
- שוקלים את המסות הרצויות של הליגנדות וממיסים אותן בחיץ עבודה מסונן. אם ריכוזי הליגנד הרצויים דורשים מסות קטנות מכדי לשקול במדויק, הכינו תמיסת מלאי ליגנד מרוכזת (פי 10 למשל).
הערה: חיוני שכל ניסויי DSC ישתמשו באותו חיץ עבודה עבור הדגימה והליגנד, כלומר, לעולם לא יבצעו ניסוי שבו הליגנד מומס באצווה שונה של חיץ עובד מאשר הביומולקולה מכיוון שהדבר יגרום לאי-התאמה של חיץ בנתונים.
- סנן את תמיסת מלאי הביומולקולות דרך מסנן 0.2 מיקרומטר ששוקל היטב עם מאגר העבודה.
- לקבוע את ריכוז הביומולקולות על ידי מדידות ספיגה (260 ננומטר עבור חומצות גרעין כמו MN4 ו 280 ננומטר עבור חלבונים).
- אחסנו את הביומולקולה והליגנד המוכנים במקרר 4°C (מתאים ל-MN4 ולליגנדות המשמשות כאן), או בטמפרטורה של -20 או -80°C אם הביומולקולה והליגנדות עמידות בהקפאה ונדרש אחסון לטווח ארוך. נטרל את תמיסות החיץ, הביומולקולה והליגנד בדגאסר שולחני (ראה טבלת חומרים) לפני הטעינה ל- DSC.
הערה: פירוק גזים מסייע במניעת היווצרות בועות ב-DSC בטמפרטורות גבוהות יותר. בועות גורמות לארטיפקטים של אותות המסתירים את צורות השיא וקווי הבסיס של DSC.
2. הכנת DSC
- פתח את ידית הלחץ מה- DSC (ראה טבלת חומרים).
- הפעל צינורות סיליקון ממאגר העבודה וחבר אותו לאוגן הקדמי (פתח מתכת) של נימי הייחוס.
- צור גשר בין נימי הייחוס והדגימה על-ידי חיבור אוגן הייחוס האחורי לאוגן הדגימה הקדמי.
- חברו חתיכת צינור סיליקון לאוגן הדגימה האחורי שעובר לבקבוק פסולת עם קו ואקום מחובר.
- הפעל את קו הוואקום כדי לשטוף את ה- DSC עם 200 מ"ל של מאגר עבודה.
- טען את נימי הייחוס של DSC עם מאגר העבודה. חברו כ-3-5 ס"מ של צינורות סיליקון לאוגני נימי הייחוס.
- הכנס קצה פיפטה בנפח 1 מ"ל לצינורות הסיליקון של האוגן האחורי. צייר 0.8 מ"ל של חיץ עבודה עם פיפטה והכנס את קצה פיפטה עם חיץ לתוך צינורות הסיליקון של אוגן הייחוס הקדמי.
- לחץ בעדינות על בוכנה פיפטה כלפי מטה כדי להעביר את חיץ העבודה דרך צינור הסיליקון הקדמי לתוך נימי הייחוס ומעלה אל קצה הפיפט המחובר של האוגן האחורי. לחץ למטה על בוכנה פיפטה עד שרמת חיץ העבודה תגיע ממש מעל צינור הסיליקון הקדמי, ואז שחרר את בוכנה פיפטה עד שרמת חיץ העבודה תגיע ממש מעל צינור הסיליקון האחורי.
- חזור על העברת מאגר העבודה קדימה ואחורה כדי לטהר את עוצמת הקול בנימי הייחוס של בועות.
הערה: בדרך כלל, 10 מעברים של התמיסה קדימה ואחורה מספיקים כדי לנקות בועות כלשהן.
- מכסים את קצה הפיפטה האחורי עם האגודל ומושכים בעדינות כלפי מעלה את קצה הפיפטה האחורי ואת הפיפטטה הקדמית כדי להסיר אותם מאוגני הייחוס עם צינורות הסיליקון מחוברים.
- טען את נימי הדגימה עם מאגר העבודה כמו בשלבים 2.6 - 2.9. הניחו מכסה פלסטיק שחור על הייחוס האחורי ודגמו אוגנים, תוך השארת האוגנים הקדמיים חשופים.
- חבר את ידית הלחץ.
- פתח את תוכנת DSC (ראה טבלת חומרים) ולחץ על המכשיר על-ידי לחיצה על החץ האדום למעלה בחלק העליון של הממשק לאחר שקריאת החשמל התייצבה; עוצמת DSC מצוינת בתיבה בפינה השמאלית העליונה של הממשק יחד עם טמפרטורת המכשיר וקריאת הלחץ.
הערה: נטר את קריאת החשמל בזמן שה- DSC לוחץ. שינויים בעוצמה של יותר מ ~ 10 μW מצביעים על היווצרות בועות בנימים, אשר יכול לגרום artifacts בנתונים. יש להסיר את התמיסות ולסלק אותן עוד לפני שממשיכים.
- אזן את ה- DSC עם מאגר העבודה על-ידי ביצוע סריקה קדימה ואחורה. בכרטיסייה "שיטה ניסיונית" בצד שמאל של המסך, ודא שהאפשרות "סריקה" נבחרה להפעלת DSC במצב סריקת טמפרטורה.
הערה: פרמטרים ניסיוניים הם טווח סריקת הטמפרטורה, קצב הסריקה, זמן שיווי משקל בטמפרטורה נמוכה וגבוהה ומספר הסריקות.
- בשיבוץ "פרמטרים של טמפרטורה" תחת הכרטיסייה "שיטה ניסיונית", לחץ על הלחצן עבור "חימום". הזן 1 ו- 100 ° C עבור טמפרטורות הניסוי התחתונות והעליונות, 1 ° C לדקה עבור קצב הסריקה, ו- 60 שניות עבור תקופת שיווי המשקל.
- לחץ על הלחצן "הוסף סדרה" מתחת לשדה הקלט עבור תקופת האיזון. הזן 2 בשדה "שלבים להוספה" בחלון הקופץ (לחימום אחד וסריקת קירור אחת) וסמן את התיבה "חימום/קירור חלופי". לחץ על "אישור"; הסריקות שנוספו מופיעות בחלק התחתון של הממשק. בדוק שהפרמטרים עבור כל סריקה הם כרצונך.
- התחל את הניסוי על ידי לחיצה על כפתור "הפעל" הירוק בחלק העליון של הממשק. נווט אל התיקיה הרצויה והזן שם קובץ לשמירת הניסוי בחלון הקופץ. הצג את התקדמות הניסוי על ידי לחיצה על הכרטיסייה "נתונים" מימין לכרטיסייה "שיטת ניסוי".
3. איסוף ערכות נתונים של Thermolabile Ligand DSC
הערה: ההליך המינימלי מורכב מחמישה ניסויים: ניסויי ייחוס חיץ עם ובלי ליגנד (המשמש לחיסור קו בסיס), ניסויים לדוגמה עם הביומולקולה החופשית, הביומולקולה הקשורה לליגנד, והביומולקולה הקשורה לליגנד עם תקופת שיווי משקל ארוכה יותר בטמפרטורה גבוהה.
- הפעל ניסויי ייחוס לצורך חיסור קווי בסיס של נתוני הדגימה. טען מחדש את ה- DSC עם מאגר העבודה בשני הנימים ואסוף סריקות מרובות קדימה ואחורה בטווח טמפרטורות מתאים ב- 1 ° C min-1 עם זמן שיווי משקל עליון (טמפרטורה גבוהה) של 120 שניות.
- מחק את סריקות איזון המאגר הקודמות מהחלק התחתון של הממשק על ידי סימון כל אחת בנפרד ולחיצה על ה- X האדום בפינה השמאלית האמצעית של הממשק. הוסף את הסריקות החדשות על ידי לחיצה על כפתור "הוסף סדרה", הזנת 20 בשדה עבור "שלבים להוספה" וסימון התיבה "חימום / קירור חלופי". לחץ על אישור והפעל את הניסוי על-ידי לחיצה על לחצן ההפעלה הירוק כמפורט לעיל.
- חזור על שלבים 3.1 - 3.1.1 עם מאגר העבודה המכיל את הריכוז הרצוי של ליגנד בשני הנימים כדי להשיג את ניסויי הייחוס עבור הליגנד (אסוף שני ניסויים נפרדים באמצעות זמני שיווי משקל של 120 שניות ו- 600 שניות בטמפרטורה גבוהה בהתאמה, שישמשו ברכישת קבוע הקצב להמרת ליגנד תרמולאבילי).
הערה: קצב הסריקה המשמש כאן מבטיח שהביומולקולה בניסויים הבאים תהיה בשיווי משקל תרמי בסריקות קדימה ואחורה. קצבי סריקה < 0.1 - 0.2 ° C min-1 מובילים לתרמוגרמות רועשות ואינם ישימים בניסויי DSC. הטמפרטורות צריכות להשתרע הרבה מתחת לטמפרטורת ההתכה של הביומולקולה החופשית להרבה מעל טמפרטורת ההתכה של הביומולקולה רוויית הליגנד (~ 20 - 80 מעלות צלזיוס עבור MN4). ודא את יכולת השחזור של הסריקות (לדוגמה, 10 סריקות קדימה ו- 10 סריקות לאחור עבור 20 בסך הכל מספיקות).
- אם אתם משתמשים במספר ליגנדים (כגון קוקאין וכינין), שטפו את ה-DSC ב-200 מ"ל של חיץ עבודה (חזרו על הפעולה משלב 2.5) בין הריצות על מנת להסיר ליגנדים מהנימים ולמנוע זיהום צולב.
הערה: כדאי לבצע ניסוי שכפול על הביומולקולה החופשית לאחר ריצה קשורה לליגנד על מנת לבדוק אם הליגנד הקודם נספג חזק לדפנות הנימים ואינו מוסר כראוי עם שטיפת חיץ. אם נראה שהתרמוגרמות של הביומולקולה החופשית הוזזו לגודל גדול יותר ולטמפרטורת דנטורציה גבוהה יותר לאחר ניסוי הליגנד, סביר להניח שהליגנד הקודם עדיין קיים בקלורימטר לאחר השטיפה. הסר את הליגנד נספג על ידי דגירה על נימים עם 20% Contrad-70 למשך שעה אחת ב 60 ° C עם מכסה פלסטיק וידית לחץ כבוי. בתוכנת DSC, שנה את מצב הניסוי ל"איזותרמי" תחת הכרטיסייה שיטת ניסוי. בחר 3,600 שניות למשך הזמן ו- 60 ° C לטמפרטורה האיזותרמית, עם אפס שהוזן לזמן שיווי המשקל. לחץ על "הוסף לשיטה ניסיונית". הניסוי האיזותרמי מופיע בחלק התחתון של המסך. לאחר השלמתו, שטפו את המכשיר עם 2 ליטר מים שעברו דה-יוניזציה וחזרו על הפעולה משלב 2.5.
- הפעל ניסויים לדוגמה באמצעות אותו הליך טעינת DSC ופרמטרים ניסיוניים כמו סריקות הייחוס. עבור ערכת הנתונים של הביומולקולות החופשיות, ודא שנימי הייחוס מכילים את מאגר העבודה ואילו נימי הדגימה מכילים את הביומולקולה החופשית בריכוז הרצוי במאגר העבודה.
- עבור ניסויים הקשורים לליגנד, ודא שהליגנד נמצא במאגר העבודה בנימי הייחוס, והביומולקולה בתוספת ליגנד נמצאת במאגר העבודה בנימי הדגימה. שטפו את המערכת בין תוספות של ליגנדות שונות כמו בשלב 2.5.
- בצע ניסוי אחד נוסף עם הביומולקולה הקשורה לליגנד התרמולאביל שבו תקופת שיווי המשקל בטמפרטורה גבוהה גדלה ל -600 שניות וכל שאר הפרמטרים הניסיוניים זהים לשלב 3.2.1.
הערה: משך תקופת שיווי המשקל בטמפרטורה גבוהה עבור ניסוי הליגנד השני נבחר פשוט כדי להבטיח שהליגנד יתרוקן מהר יותר מאשר ניסוי זמן שיווי המשקל הקצר. אם הפסגות הקשורות לליגנד מהניסוי הראשון דועכות באיטיות כפונקציה של מספר הסריקה (למשל, ההבדלים במקסימום שיא עוקב הם ≤ 0.5 מעלות צלזיוס), העריכו עליות של פי 10 עד פי 20 בתקופת שיווי המשקל בטמפרטורה גבוהה על מנת לרוקן כראוי את הליגנד במהלך הניסוי השני. החישוב המדויק של קבוע הקצב להמרת ליגנד מחייב שבניסוי השני תהיה דלדול מהיר יותר של הליגנד ביחס לראשון. ריכוזי הליגנד שהופקו מהניתוח העולמי של שני הניסויים יהיו דומים ולכן בלתי שמישים אם דלדול הליגנד לא יואץ מספיק בניסוי השני.
4. עיבוד נתונים
- פתח את קובצי הניסוי של DSC בתוכנת ניתוח הנתונים DSC (ראה טבלת חומרים) וייצא את נתוני החשמל הגולמיים כגליונות אלקטרוניים.
- יבא את הגיליונות האלקטרוניים המכילים את נתוני החשמל הגולמיים לתוכנה לצורך התאמת נתונים.
- קו הבסיס החסר את נתוני הדגימה על-ידי חיסור נתוני עוצמת המאגר מניסויי הביומולקולות החופשיות והליגנדיות.
הערה: בניסוי הליגנד התרמולאבילי, ריכוז הליגנד הראשוני יורד עם כל סריקה. לכן, זה אידיאלי להחסיר את סריקת חיץ 1 מן מדגם סריקה 1, וכן הלאה. גילינו שסריקות החיץ עם קוקאין אינן משתנות במידה ניכרת ככל שהמרת הליגנד מתקדמת, ולכן ניתן להשתמש בסריקת מאגר ליגנד תרמולאבילית יחידה כדי להחסיר את כל הנתונים הקשורים לליגנד התרמולבילי.
- המר את נתוני צריכת החשמל לדוגמה שהוחסרו בקו הבסיס לקיבולת חום.
הערה: ההמרה דורשת נפח ספציפי חלקי של המולקולה, אשר ניתן להעריך.
5. ניתוח נתונים
- התאם באופן גלובלי את זמן שיווי המשקל הקצר של ערכת נתוני קיבולת חום קשורה לליגנד תרמולאבילי עם קבוצה אחת של פרמטרים בסיסיים, ריכוז ליגנד, קיפול וקשירת ליגנד.
- חזור על ההתאמה הגלובלית עבור ערכת הנתונים של זמן שיווי משקל ארוך על מנת לחשב את קבוע הקצב עבור המרת ליגנד תרמולאביל.
