$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. הכנת CXCL12, Assay Buffer ותאי Jurkat למבחן מחייב התחרות
- הכינו תמיסת מלאי של CXCL12AF647 (20 מיקרוגרם/מ"ל; ראו טבלת חומרים וריאגנטים) על ידי המסת מגיב ליופילי (מאוחסן בטמפרטורה של -80°C, בחושך) במים אולטרה-טהורים בתוספת 0.01% (נפח/נפח) של פוליסורבט 20. אחסן Aliquots חד-פעמי מתמיסת מלאי זו בטמפרטורה של -80°C, מוגן מפני אור.
- הכינו את חיץ הבדיקה על ידי הוספת 40 מ"ל HEPES (ריכוז סופי של 1 M, 20 mM) לתמיסת מלח מאוזנת של Hank של 200 מ"ל (HBSS, 10x, ללא פנול אדום וללא סודיום ביקרבונט, ריכוז סופי 1x). הוסיפו מים אולטרה-טהורים לקבלת נפח סופי של 2 ליטר. הוסיפו 4 גרם (0.2% משקל/נפח) אלבומין בסרום בקר (BSA), והמיסו את ה-BSA באמצעות ערבוב מגנטי. לבסוף, כוונן את ה- pH ל- 7.4 (השתמש ב- NaOH לשם כך) וסנן את התמיסה דרך נקבוביות 0.2 מיקרומטר (ראה טבלת חומרים וריאגנטים) באמצעות סעפת ואקום.
הערה: מאגר בדיקה זה ישמש בכל השלבים הנוספים של הפרוטוקול.
- ספור את המספר ואת הכדאיות של תאי Jurkat. לשם כך, קח דגימה של תרחיף התא ודלל אותו במי מלח חוצצים פוספט (PBS).
הערה: אנו משתמשים באופן שגרתי במנתח כדאיות תאים אוטומטי (ראה טבלת חומרים וריאגנטים) המסוגל לספור תרחיפים של תאים בריכוזים משתנים. עבור ספירת תאים, לדלל 0.5 מ"ל של תרחיף התא ב 1.5 מ"ל PBS (דילולים אחרים, למשל, 0.1 מ"ל ב 1.9 מ"ל PBS, אפשריים גם). מספר מכשירים אחרים זמינים באופן מסחרי לספירת מספרי תאים וכדאיות שאמורים לעבוד באותה מידה.
- אסוף את מספר התאים הרצוי (כלומר, ~ 24 x 106 תאים כדי להפעיל את הבדיקה עם צלחת אחת שלמה של 96 בארות) בצינור סטרילי של 50 מ"ל על ידי צנטריפוגה (ראה טבלת חומרים וריאגנטים עבור סוג הצנטריפוגה בה נעשה שימוש) ב 400 x גרם למשך 5 דקות ב- RT.
- שפכו בעדינות את הסופרנאטנט מבלי להפריע לכדורית התא. הוסף חיץ בדיקה טרי (למשל, 20 מ"ל) והשהה מחדש את התאים על ידי פיטום עדין למעלה ולמטה.
- צנטריפוגה את התאים שוב ב 400 x גרם במשך 5 דקות ב RT.
- שפכו שוב את הסופרנאטנט והשהו מחדש את כדורית התא במאגר בדיקה טרי לקבלת צפיפות של 5 x 106 תאים / מ"ל.
2. מבחן מחייב תחרות
הערה: בדיקת התחרות המחייבת בפועל מבוצעת ב- RT וניתן לבצע אותה בתנאים לא סטריליים.
- לדלל את התרכובות הנחקרות במאגר הבדיקה (ראה 1.2) כדי להשיג את הריכוז הרצוי. או להכין ריכוז קבוע של תרכובת לסינון ראשוני (למשל, ריכוז סופי של 10 מיקרומטר) או, לחילופין, סדרת דילול סדרתי של ריכוזים לאפיון מפורט יותר של התרכובות (למשל, סדרת דילול של 1/3, 1/4 או 1/5 החל מ-1 מיקרומטר, ריכוז סופי). יש לזכור כי הפתרון המורכב יהפוך בסופו של דבר 2x מדולל בבדיקה; לכן, הכינו תמיסה מרוכזת פי 2.
- יש לפזר 100 μL של תמיסת תרכובת (2x מרוכזת) לתוך לוח תחתון עגול שקוף בן 96 בארות (ראו טבלת חומרים וריאגנטים) בהתאם למערך ניסויי מוגדר מראש (לדוגמה, איור 1C).
הערה: בשלב זה, דגימות בקרה שליליות וחיוביות נכללות בבדיקה. במדגם הבקרה השלילית, 100 μL של חיץ הבדיקה מתווסף במקום התרכובת לבארות של צלחת 96 בארות. עבור מדגם הבקרה החיובית, נוסף גם מאגר בדיקה במהלך שלב זה. ראו גם איור 1C עבור מערך ניסויי טיפוסי שבו נבדקת סדרת דילול של כמה תרכובות.
- הוסף 50 μL של תרחיף תאים (ראה 1.7; 0.25 x 106 תאים) ממאגר מגיב לתוך צלחת 96 בארות באמצעות פיפטה רב ערוצית. דוגרים על הצלחת במשך 15 דקות ב- RT בחושך.
- הוסף 50 μL של CXCL12 המסומן באופן פלואורסצנטי (כלומר, 100 ננוגרם/מ"ל של CXCL12AF647 במאגר בדיקה, מרוכז פי 4, ריכוז סופי של 25 ננוגרם/מ"ל) ממאגר מגיבים דומה לבארות של צלחת 96 הקידוחים. דגירה במשך 30 דקות ב- RT בחושך.
הערה: עבור דגימות הבקרה השליליות, הוסף מאגר assay במקום זאת. לפיכך, האות הפלואורסצנטי שזוהה בדגימות הבקרה השליליות יתאים לאות הרקע האוטו-פלואורסצנטי (איור 1A). עבור דגימות הבקרה החיוביות, הוסף 50 μL/well של CXCL12AF647. דגימות הבקרה החיוביות יניבו את האות הפלואורסצנטי המרבי שזוהה, מאחר שלא נכלל עיכוב פוטנציאלי על-ידי קדם-דגירה עם תרכובות (איור 1A).
- צנטריפוגו את הצלחת בעלת 96 הקידוחים במהירות של 400 x גרם למשך 5 דקות ב-RT. הוציאו את הסופרנאטנט מהתאים הכדוריים על ידי היפוך הצלחת. יבש את הצלחת על רקמה.
- הוסף 200 μL של חיץ בדיקה טרי ממאגר מגיב לבארות באמצעות פיפטה רב ערוצית. מיד המשך.
- צנטריפוגו את הצלחת שוב למשך 5 דקות ב 400 x גרם ב RT. מוציאים את הסופרנאטנט על ידי היפוך הצלחת ושוב מייבשים אותו על רקמה.
- השהה מחדש בעדינות את גלולת התא ב 200 μL של 1% paraformaldehyde מומס PBS. שלב זה יתקן את התאים.
- המשך את הפרוטוקול מיד עם כימות הפלואורסצנטיות על ידי ציטומטריית זרימה.
3. ניתוח הדגימות לפי ציטומטריית זרימה
CXCL12AF647 תאים מוכתמים ומקובעים מוכנים כעת לניתוח באמצעות ציטומטריית זרימה. ניתן להשתמש במספר סוגים של ציטומטרים של זרימה, אך עליהם להיות מצוידים בלייזר הנכון (כלומר, לייזר אדום, טווח עירור ~ 630 ננומטר) לעירור ומסננים מתאימים לזיהוי פלואורופור (מסנני פליטה ~ 660 ננומטר). הם צריכים להיות מסוגלים לטפל בדגימות בפורמט צלחת 96 באר. דוגמאות להתקני ציטומטריית זרימה מתאימים ניתנות בטבלת החומרים והריאגנטים.
- הפעל את ההתקן ופתח את התוכנה המתאימה (ראה טבלת חומרים וריאגנטים).
- בחר את הפרמטרים התאיים הבאים להצגה חזותית בתבנית כתם נקודה: פיזור קדימה (FSC), פיזור צדדי (SSC) וערוץ זיהוי פלואורופור (CXCL12AF647).
הערה: עם הפרמטר FSC, תאים מופלים על פי גודלם, שכן בליעת האור שזוהתה פרופורציונלית לקוטר התא. פרמטר SSC, המודד פיזור אור בזווית של 90°, מספק מידע על רמת הפירוט של התאים.
- בחר דגימה אחת (לדוגמה, דגימת ביקורת שלילית) כדי לבצע gating של אוכלוסיית תאים הומוגנית מוגדרת בהתבסס על הפרמטרים FSC ו- SSC.
- בחר הזרקה אוטומטית של ~100 μL של תאים מקובעים מדגימת בקרה שלילית זו לתוך ציטומטר הזרימה. בחר באפשרות "ערבוב" לפני ההזרקה והשתמש בקצב זרימת דגימה של 1.5 μL/s.
- הפעל דוגמה זו על-ידי בחירה באפשרות "רכוש נתונים". הפרמטרים FSC ו- SSC עבור מדגם זה יופיעו כעת על המסך.
- בחר את כלי ה- gating של התוכנה. בהתבסס על התצוגה החזותית של כתם נקודות FSC ו- SSC, הגדר מראש אוכלוסיית תאים הומוגנית ובת קיימא על ידי גידור. לשם כך, צור מצולע (באמצעות כלי ה- gating של התוכנה) הכולל את התאים הבודדים המפוזרים באופן הומוגני ("אירועים") בהתבסס על שני ממדים אלה.
הערה: הליך ה-gating נועד להגדיר אוכלוסיית תאים הומוגנית ובת קיימא שתשמש לניתוח נוסף. גאטינג מסתמך על ההנחה שרוב התאים בני קיימא יהוו אוכלוסיית תאים הומוגנית בהתבסס על הפרמטרים FSC ו-SSC. על ידי ביצוע שלב זה, פסולת תאית, תאים מתים וצברי תאים יכולים במידה רבה להישלל מניתוח נוסף. המחשה של תהליך הגאטינג מוצגת באיור 1B.
- בחר לנתח 20,000 "אירועים" (כלומר, תאים בודדים) לכל דגימה.
הערה: המשמעות היא שעבור כל דגימה, 20,000 תאים שנמצאים בתוך השער שהוגדר מראש ינותחו בסופו של דבר. איסוף הנתונים עבור כל מדגם יימשך עד לניתוח מספר אירועים זה.
- התחל את ההפעלה (בחר "הקלט נתונים"). התקן ציטומטריית הזרימה ינתח כעת את כל הדגימות אחת אחת על ידי רישום עוצמת הפלואורסצנטיות הממוצעת (MFI) עבור כל דגימה. MFI זה מתאים לאות הפלואורסצנטי הממוצע המתאים ל-20,000 התאים הנמצאים בתוך השער שהוגדר מראש.
