בדיקת כתב מבוססת ELISA לחקר האינטראקציה בין קולטן לליגנד בתאי BW

תקציר

מקור: Elias, S. et al., A BW Reporter System for Study Receptor-Ligand Interactions. J. Vis. Exp. (2019)

סרטון זה מדגים את הזיהוי מבוסס הכתב של האינטראקציה בין הקולטן לליגנד. האינטראקציה המוצלחת בין הקולטן לליגנד מפעילה את מסלול האיתות במורד הזרם, וגורמת ליצירה ושחרור של ציטוקינים כמולקולות כתב הפרשה בתמיסה, אשר מאושרת באמצעות ELISA.

פרוטוקול

1. יצירת פלסמיד המבטא את המבנה הכימרי

הערה: המטרה היא ליצור פלסמיד שמבטא את התחום החוץ-תאי של קולטן העניין המאוחה לתחומים הטרנסממברנליים והתוך-תאיים של שרשרת CD3ζ של העכבר (איור 1A).

1. אחזר את הרצף של התחום החוץ-תאי של הקולטן המעניין כולל פפטיד האות. להשיג חומר DNA שצפוי לבטא קולטן זה (למשל, cDNA או פלסמיד).
2. קבל חומר DNA המבטא את הטרנסממברנה ואת התחומים התוך-תאיים של שרשרת CD3ζ של העכבר (למשל, cDNA או פלסמיד).
3. תכננו את הרצף של חלבון ההיתוך בהתבסס על המבנה הכללי שמוצג באיור 1A. ודא שכל הרצף נמצא באותה מסגרת קריאה של קודון. רצף זה משמש לעיצוב פריימרים מתאימים ולאימות המוצר הסופי.
4. תכננו שתי תגובות PCR כדי להגביר כל אחד מהשברים של חלבוני ההיתוך בנפרד (איור 1B, 1C).
   הערה: התנאים הספציפיים לתגובות PCR (למשל, זמן התארכות וטמפרטורת חישול) תלויים באופי הפריימרים, המיועדים לקולטן ספציפי.
   1. להגביר את המקטע החוץ תאי של הקולטן.
      1. תכננו פריימר בגודל 5 אינץ' הכולל חלק מפפטיד האות של הקולטן, רצף קונצנזוס של קוזאק ואתר הגבלה מתאים (איור 1B).
      2. תכננו פריימר בגודל 3 אינץ' שמשני חלקי חלבון ההיתוך (איור 1B). לדוגמה, עבור התכנון הראשוני, פריימר 3' זה יכול לכלול את 20 זוגות הבסיס האחרונים של המקטע החוץ תאי של הקולטן ואת 9 זוגות הבסיס הראשונים של קטע CD3ζ.
         הערה: אין צורך להוסיף אתר הגבלה לפריימר 3' מכיוון שפריימר זה ישמש ליצירת רצף ההתכה, ואינו משמש לקשירה.
   2. להגביר את קטע CD3ζ.
      1. תכננו פריימר בגודל 5 אינץ' שמשני חלקי חלבון ההיתוך (איור 1C). לדוגמה, עבור התכנון הראשוני, פריימר 5' יכול לכלול את 9 זוגות הבסיס האחרונים של המקטע החוץ תאי של הקולטן ואת 20 זוגות הבסיס הראשונים של קטע CD3ζ.
         הערה: אין צורך להוסיף אתר הגבלה לפריימר 5' מכיוון שפריימר זה ישמש ליצירת רצף האיחוי, ואינו משמש לקשירה.
      2. תכננו פריימר בגודל 3 אינץ' הכולל את סוף רצף CD3ζ וכן אתר הגבלה מתאים (איור 1C).
   3. תקנו את רצפי הפריימר בכל אחת משתי התגובות הללו כך שטמפרטורת החישול תהיה דומה בכל זוג (שימו לב שהפריימר, הכולל רצפים של שני חלקי חלבון ההיתוך, כולל רק רצפים עם חלק מהרצף בכל תגובה).
5. בצע PCR נוסף שבו תערובת של תוצרי PCR של שתי התגובות הראשונות משמשת כתבנית DNA עם פריימר 5' של מקטע הקולטן החוץ תאי (שלב 1.4.1.1) ו-3' של מקטע CD3ζ (שלב 1.4.2.2) (איור 1D). תגובה זו אמורה ליצור את הרצף המאוחה הסופי.
6. המשך כרגיל לשכפול.
   1. קשר את מוצר ה- PCR הסופי לווקטור חיתוך המטרה (וקטור המטרה הוא בדרך כלל pcDNA3 המבטא עמידות G418 ואמפיצילין).
   2. הפוך את הווקטור המקושר לחיידקים מוכשרים.
      1. הפשירו 50 מיקרוליטר של החיידקים המוסמכים על קרח.
      2. מוסיפים את הווקטור המקושר לחיידקים ודגרים על קרח במשך 20 דקות.
      3. לדגור ב 42 ° C במשך 45 שניות.
      4. הוסף 200 μL של LB ללא אנטיביוטיקה.
      5. יש לדגור במשך שעה אחת ב-37°C (37°) עם רעידות מתמשכות.
      6. זרע על צלחת LB עם אנטיביוטיקה מתאימה (למשל, תמיסת אמפיצילין עם ריכוז סופי של 0.1 מ"ג / מ"ל).
   3. לאסוף ולגדל כמה מושבות חיידקים ב 5 מ"ל של LB (בצינורות 15 מ"ל).
   4. למחרת, לחלץ פלסמידים עם ערכת הכנה קטנה.
   5. לנתח את הכנס הגן עם אנזימי הגבלה.
   6. רצף את המושבות הרלוונטיות וודא שהרצף ומסגרת הקריאה נכונים (כפי שמצוין בשלב 1.3).
7. הפוך את הפלסמיד המאומת לחיידקים מוכשרים.
   1. הפשירו 20 מיקרוליטר של החיידקים המוסמכים על קרח.
   2. מוסיפים 1 μL של פלסמיד לחיידקים ולדגור על קרח במשך 20 דקות.
   3. לדגור ב 42 ° C במשך 45 שניות.
   4. הוסף 200 μL של LB ללא אנטיביוטיקה.
   5. יש לדגור במשך שעה אחת ב-37°C (37°) עם רעידות מתמשכות.
   6. זרע על צלחת גידול חיידקים עם אנטיביוטיקה מתאימה (למשל, תמיסת אמפיצילין עם ריכוז סופי של 0.1 מ"ג / מ"ל).
8. למחרת, לגדל מושבת חיידקים במיכל LB גדול עם 0.1 מ"ג / מ"ל אמפיצילין (~ 250 מ"ל).
9. למחרת, בצע הכנת מקסי בהתאם להוראות הספציפיות שסופקו על ידי הערכה.
   הערה: לצורך הליך האלקטרופורציה נדרשת כמות גדולה של פלסמיד, כמפורט להלן.

2. טרנספקציה של הפלסמיד המבטא את החלבון הכימרי לתאי BW

הערה: ניתן להשתמש גם בשיטות שונות לטרנספקציה (למשל, על ידי זיהום לנטיויראלי). לפני ההתחשמלות, לבצע משקעים אתנול של ה- DNA כמתואר להלן. השלבים הבאים דורשים תנאים סטריליים.

1. יום לפני, הכינו את תאי BW5147 ("תאי BW") לאלקטרופורציה. צלחת 10 צלחות (של 10 ס"מ) עם 10 מ"ל של 100,000 BW5147 תאים/מ"ל (כלומר, סה"כ 10 x 10⁶ תאים) עם RPMI בתוספת 10% סרום עגל עוברי (FCS), 1% נתרן פירובט, 1% L-גלוטמין, 1% חומצות אמינו לא חיוניות ו-1% פניצילין-סטרפטומיצין ("מדיום מלא").
2. מניחים 100 מיקרוגרם של פלסמיד pcDNA3 המבטא את חלבון ההיתוך בצינור 1.5-2 מ"ל ומוסיפים לו 3 M נתרן אצטט ב- pH 5.3-5.5. נפח הנתרן אצטט צריך להתאים ל -0.1 (10%) מנפח הפלסמיד של 100 מיקרוגרם; titrate את ה- pH של אצטט נתרן עם מד pH על ידי הוספת NaOH או HCl.
3. הוסף 2.5 כרכים של 100% אתנול לתערובת של פלסמיד ונתרן אצטט כמתואר בשלב 2.2 (פי 2.5 מהנפח הכולל של פלסמיד ונתרן אצטט). יש לדגור למשך הלילה ב-20°C (-20°C) או למשך שעתיים ב-70°C (70°C).
4. 24 שעות לאחר ציפוי תאי BW, אספו את כל תאי BW (~ 100 מ"ל) בצינורות של 2 50 מ"ל. צנטריפוגו את התאים למשך 5 דקות במהירות של 515 x גרם והשליכו את הסופרנטנט.
5. השהה מחדש את הגלולה משני הצינורות ב 25 מ"ל של RPMI - בצינור יחיד 50 מ"ל. לדוגמה, להשעות מחדש את הגלולה של צינור אחד עם 25 מ"ל של RPMI- ולאחר מכן להשתמש בנוזל זה כדי להשעות מחדש את הנוזל בצינור 50 מ"ל האחרים כך שהגלולה הכוללת מתאי BW תהיה תלויה מחדש ב 25 מ"ל של מדיום בצינור יחיד.
   הערה: המדיום צריך להיות ללא תוספות מכיוון שהסרום עלול להפריע להתחשמלות.
6. צנטריפוגה את התאים שוב במשך 5 דקות ב 515 x גרם. משעים מחדש את הגלולה ב 1 מ"ל של RPMI, ומעבירים את התוכן לקובט 0.4 ס"מ על קרח.
7. צנטריפוגה פלסמיד שעבר משקעים אתנול (שלב 2.3) במשך 30 דקות ב 16,000 x גרם ו 4 ° C.
8. יש לשטוף פעם אחת עם 1 מ"ל של 70% אתנול וצנטריפוגה למשך 20 דקות נוספות בטמפרטורה של 16,000 x גרם ו-4°C (כדי לשטוף את המלח).
9. מוציאים את כל האתנול ונותנים לגלולה להתייבש מעט (כלומר, בצינור פתוח במכסה המנוע של תרבית הרקמה). להשעות את הגלולה עם 100 μL של RPMI - בעבר מחומם ל 60 ° C.
10. מוסיפים את הפלסמיד המרחף מחדש (שלב 2.8) לתאים בקובט ודגורים במשך 5 דקות על קרח.
11. אלקטרופורציה התאים ב 0.23 kV, 250 קיבול. זה אמור לקחת ~ 4 אלפיות השנייה.
12. מעבירים את התאים המחושלים לצינור של 50 מ"ל, מוסיפים 50 מ"ל של תווך שלם, וצנטריפוגה למשך 5 דקות ב 5,15 x גרם.
13. השליכו את הסופרנאטנט והשעו מחדש את התאים עם 50 מ"ל של מדיום שלם.
14. צלחת את התאים electroporated בצלחות תרבית 24 בארות (1 מ"ל לכל באר, עבור סך של ~ 50 בארות) ולדגור ב 37 ° C ו 5% CO₂ במשך 48 שעות.
15. בחר את התאים הנגועים באנטיביוטיקה. לאחר 48 שעות להוסיף 1 מ"ל של מדיום שלם בתוספת 10 מ"ג / מ"ל G418 לכל באר (בשלב זה הנפח הסופי בכל באר הוא 2 מ"ל והריכוז הסופי של G418 בכל באר הוא 5 מ"ג / מ"ל).
    הערה: אם הפלסמיד מכיל עמידות אנטיביוטית שונה, קבע את ריכוז האנטיביוטיקה הדרוש כדי להרוג את תאי BW הלא נגועים לפני שלב זה.
16. כל 48 שעות, יש להשליך בזהירות 1 מ"ל מהנפח העליון של כל באר מבלי לערבב את המדיום בבאר (תאי BW נוטים להיות בתחתית הבאר). הוסף מדיום שלם בתוספת 5 מ"ג / מ"ל G418 לכל באר, כך שהנפח הסופי בכל באר הוא שוב 2 מ"ל.
17. בדוק את לוחות התרבית לגידול תאים בכל הבארות באופן קבוע.
    הערה: שינוי בצבע המדיום לצהוב עשוי לסייע בזיהוי תאים גדלים; עם זאת, בהתחלה, המדיום יהיה צהוב בגלל G418 עצמו. זיהוי בארות חיוביות (בארות עם תאים גדלים). בארות אלה עמידות בפני G418 ולכן צפויות לבטא את חלבון ההיתוך. תהליך זה אורך בדרך כלל ~3 שבועות.

3. אימות ביטוי הקולטן הנגוע בתאים בבארות החיוביות.

1. הכתימו את תאי BW הנגועים בנוגדן ספציפי כנגד הקולטן שהיה נגוע.
2. השווה את רמת הביטוי של הקולטן לפי ציטומטריית זרימה לביטוי תאי הבקרה (תאי BW לא נגועים).
3. לאחר אימות באר אחת או יותר, השתמש בתאים באופן מיידי למטרות ניסוי, גדל אותם בתרבית, או הקפיא אותם ליישומים עתידיים.
4. ודא את הביטוי של הקולטן הנגוע לפני ביצוע ניסוי חדש. לאחר מספר שבועות של צמיחה, ניתן להשמיט את התאים עם G418 עם ביטוי קולטן יציב, G418 ממדיום התרבית.

4. דגירה של תאי BW נגועים עם מטרות

הערה: בעת שימוש ראשון בתאי BW נגועים, עדיף לבדוק אותם על מטרות המבטאות ליגנד ידוע של הקולטן המעניין או על נוגדנים הקשורים לצלחת המכוונים ספציפית נגד הקולטן המעניין (ניסויים צולבים; ראה להלן, סעיף 4.2.1.3).

1. רצוי, לפצל את תאי BW 24 שעות לפני הניסוי (לדוגמה, על ידי הוספת 10 מ"ל של תווך שלם עד 2 מ"ל של תאים בתרבית בלוח תרבית חדש של 10 ס"מ).
2. לדגור על תאי BW נגועים עם המטרות שלהם. בצעו את הניסוי בו זמנית על תאי ביקורת BW המבטאים וקטור ריק (או תאי BW הורים). צלחות 96F עדיפות (אך ניתן להשתמש גם בצלחות 96U). בצע את הניסוי בשלשה. השעה את כל התאים בתווך המלא.
   1. הכינו את היעדים. סוג המטרה משתנה בהתאם למטרה ויכול להיות תאים, תאים שהודגרו מראש עם נוגדנים, או נוגדנים בלבד. מערכת זו שימשה גם עם חיידקים כמטרות.
      1. אם המטרות מתחלקות תאים (כלומר, קווי תאים), הקרינו אותם ב 6,000 ראד לפני הבדיקה. מניחים 50,000 תאי מטרה בבאר אחת של צלחת 96 (בנפח של 100 μL).
      2. לניסויים עם נוגדנים ותאי BW המבטאים FcγRs אנושי, יש לדגור על תאי המטרה עם נוגדן על קרח בצלחת של 96 בארות (לדוגמה, 50 μL של תאי המטרה ו-50 μL של הנוגדן; ניתן לבדוק מנות נוגדנים שונות).
      3. אם משתמשים בנוגדנים בלבד כמטרות (ניסויים צולבים), הם צריכים להיות קשורים לצלחות. לשם כך, תחילה יש לדגור על הנוגדנים בתווך שלם בצלחת 96F למשך 1-2 שעות ב-37°C ו-5%_CO2 (מינון התחלתי טיפוסי הוא 0.5 מיקרוגרם של נוגדן ספציפי ב-50 μL). שטפו את הצלחת כדי להסיר נוגדנים לא קשורים.
         הערה: במקרה זה, צלחת 96F תאפשר קשירה של הנוגדן לצלחת, אשר לאחר הוספת תאי BW נגועים יוביל להפעלת הקולטן הנגוע
      .
   2. הוסף את תאי BW (תאי אפקטורים). מניחים 50,000 תאי BW בבאר אחת של צלחת 96 (בנפח של 100 μL).
   3. השלם את הנפח בכל באר עד 200 μL במידת הצורך.
   4. לדגור על הלוחות ב 37 ° C ו 5% CO₂ במשך 48 שעות (פרק זמן זה יכול להיות מכוייל).
3. לאחר 48 שעות, הקפיאו את הצלחות בטמפרטורה של -20°C והפשירו אותן לפני ELISA, או השתמשו בהן מיד עבור ELISA (ראו את השלבים הבאים).

5. אנונימי

1. ציפוי צלחת ELISA עם נוגדן IL-2 נגד עכבר (anti-mIL-2). יש להניח 0.05 מיקרוגרם של אנטי-mIL-2 בנפח של 50 μL של 1x PBS (מלח חיץ פוספט) לכל באר. לדגור על צלחת ELISA המצופה עם נוגדן anti-mIL-2 ב 4 ° C במשך הלילה או ב 37 ° C במשך 2 h.
   הערה: כדי לבצע ELISA מיד לאחר שלב הדגירה, יש לצפות את צלחת ELISA 24 שעות לפני תום תקופת הדגירה של תאי BW.
2. השליכו את הנוזל לצלחת ELISA והוסיפו תמיסה חוסמת (200 μL לבאר) המורכבת מ-1x PBS ואלבומין 1% בסרום בקר (BSA). דגרו על צלחת ELISA במשך שעתיים בטמפרטורת החדר.
3. לשטוף את צלחת ELISA שלוש פעמים עם 0.05% PBS Tween פתרון (כלומר, 0.5 מ"ל של Tween-20 ב 1 ליטר של 1x PBS).
4. קח את צלחת 96 אשר יש את תאי BW כי היו מודגרים עם המטרות שלהם (4.3). אם הצלחת הייתה קפואה, הפשירו אותה לחלוטין (למשל, על ידי דגירה קצרה ב-37°C). צנטריפוגו את צלחת 96 הבארות (5 דקות, 515 x גרם) והעבירו בזהירות 100 μL של הסופרנאטנט בכל באר לצלחת ELISA המצופה מראש והחסומה.
   הערה: יש לאסוף את הסופרנאטנט מדפנות כל באר כדי להימנע מלקיחת התאים.
5. אם תרצה, הוסף mIL-2 רקומביננטי עם ריכוזים מוגדרים לאחת השורות הריקות של לוח ELISA המצופה כדי ליצור עקומה סטנדרטית של mIL-2. לדוגמה, להתחיל מריכוז mIL-2 של 2,500 pg/mL ולאחר מכן לרדת ב -50% בכל באר עוקבת; אל תוסיף mIL-2 לבאר האחרונה.
6. לדגור את צלחת ELISA ב 4 ° C בלילה או ב 37 ° C במשך 2 שעות.
7. שטפו את צלחת ELISA ארבע פעמים עם PBS Tween.
8. הוסף ביוטין נגד עכבר IL-2 לצלחת ELISA. יש להשתמש בריכוז של נוגדן 1 מיקרוגרם ב-1 מ"ל של 1x PBS עם 1% BSA ולחלק ל-100 מיקרוליטר לכל באר.
9. יש לדגור בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת.
10. שטפו את צלחת ELISA שש פעמים עם PBS Tween.
11. הוסף סטרפטווידין מצומד HRP. השתמש בריכוז של 1 μL streptavidin ב 1 מ"ל של PBSX1 עם 1% BSA ולחלק אותו 100 μL לכל באר.
12. יש לדגור בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.
13. שטפו את צלחת ELISA שש פעמים עם PBS Tween.
14. הוסף 100 μL לכל באר של תמיסת מצע TMB. השלם שלב זה במהירות כדי למזער את ההבדלים בין הבארות עקב פיגורי זמן בעת הוספת TMB.
15. קרא את לוח ELISA עם קורא לוחות ELISA ב- 650 ננומטר (ניתן לחזור על הקריאה אם האות חלש).

תוצאות

איור 1: המבנה של הקולטן הכימרי-CD3ζ והעיצוב של פריימרים ל-PCR. (A) מבנה כללי של קולטן חוץ-תאי המאוחה לתחומים הטרנסממברנליים והתוך-תאיים של עכבר CD3ζ. (B) התחום החוץ-תאי של הקולטן הוגבר באמצעות פריימר 3' שכלל גם נוקלאוטידים של CD3ζ. (C) התחומים התוך-תאיים והטרנסממברנליים של CD3ζ הוגברו עם פריימר 5' שכלל גם נוקלאוטידים של קולטן. (D) בתגובת ה-PCR הסופית, שני המקטעים, שיש להם רצפים חופפים, שימשו כתבנית ד...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
AccuPrep, ערכת מיצוי פלסמיד מיני	ביוניר	K-3030
נגד עכבר IL-2	ביולג'נד	503702
ביוטין נגד עכבר IL-2	ביולג'נד	503804
צלחות ELISA	דה-גרוט	60-655061
סרום בקר עוברי	סיגמא	F7524-500 מ"ל
G418	כספית	MBS3458105GM
ג'ין פולסר II	ביו-ראד	165-2105, 165-2106, 165-2107, 165-2108, 165-2109, 165-2110
ל-גלוטמין	תעשייה ביולוגית	03-020-1B
תמיסת חומצות אמינו לא חיוניות MEM	תעשייה ביולוגית	01-340-1B
תמיסת פניצילין-סטרפטומיצין	תעשייה ביולוגית	03-031-1B
פרוקסידז סטרפטאבידין	ג'קסון מחקר חיסוני	016-030-084
ערכת Maxiprep מסנן פלסמיד PureLink HiPure	תרמופישר סיינטיפיק	K210016
RPMI-1640 בינוני	תעשייה ביולוגית	30-2001
נתרן פירובט	תעשייה ביולוגית	03-042-1B
TMB	סאות'רןביוטק	0410-01