1. בידוד RBCs אנושיים, ביוטינילציה והתאמת אוסמולריות
הערה: שלב 1.1 צריך להתבצע על ידי איש מקצוע רפואי מיומן כגון אחות, עם פרוטוקול מאושר על ידי ועדת הביקורת המוסדית.
- קבל 8-10 μl (טיפה אחת) של דם מ דקירה אצבע ולהוסיף אותו 1 מ"ל של חיץ קרבונט / ביקרבונט (רשימת חומרים). מערבלים בעדינות או פיפטה את התערובת והצנטריפוגה למשך דקה אחת ב 900 x גרם. משליכים את הסופרנאטנט ושוטפים שוב.
- בכוס קטנה שוקלים 3.5-4 מ"ג של מקשר ביוטין-PEG3500-NHS (רשימת חומרים). ממיסים אותו במאגר הקרבונט/ביקרבונט כדי להגיע לריכוז הסופי של 3 מ"ג/מ"ל.
- יש לערבב 171 μl של חיץ פחמתי/ביקרבונט, 10 μl של חבילת RBC ו-1049 μl של תמיסת קישור Biotin-PEG3500-NHS ולדגור ב-RT למשך 30 דקות. שטפו את RBC פעם אחת עם חיץ פחמתי/ביקרבונט ולאחר מכן פעמיים עם חיץ N2-5% (רשימת חומרים).
- בינתיים, מניחים את בקבוק המקשר עם פקק משוחרר במייבש ואקום מזכוכית מלא בחומרי ייבוש בתחתית ושואבים למשך 5 דקות, וממלאים את המייבש בארגון. הדקו את הפקק והוציאו את הבקבוק. אטמו את הבקבוק בסרט פרפין מפלסטיק (רשימת חומרים), הכניסו אותו למיכל מלא בחומרי ייבוש בתחתית, ואחסנו אותו בטמפרטורה של -20°C.
הערה: השלבים הכוללים שימוש במקשר ביוטין-PEG3500-NHS, כולל 1.2-1.4 (למעט הדגירה והשטיפה ב-1.3), צריכים להתבצע מהר ככל האפשר.
- יש לדלל את הניסטטין למאגר N2-5% לקבלת ריכוז סופי של 40 מיקרוגרם/מ"ל. יש לערבב 5 מיקרוליטר של RBC ביוטינילציה עם תמיסת 71.4 מיקרוליטר של ניסטטין (רשימת חומרים) ולדגור במשך שעה אחת ב-0°C. יש לשטוף פעמיים עם מאגר N2-5% ולאחסן עם מאגר N2-5% + 0.5% BSA (רשימת חומרים) במקרר (4°C).
2. סילניזציה של חרוזי זכוכית
- ניקוי משטח חרוזים
- שוקלים 50 מ"ג של אבקת חרוזי זכוכית ומרחפים אותם מחדש ב 500 מיקרוליטר של מים DI.
- מערבבים 0.5 מ"ל של 30% H2O2 (רשימת חומרים) עם 9.5 מ"ל של מי DI במיכל של 50 מ"ל, ואז מוסיפים 2 מ"ל של NH4OH מרוכז (רשימת חומרים) ומביאים תמיסה זו לדוד על צלחת חמה.
- מוסיפים את חרוזי הזכוכית לתמיסה הרותחת וממשיכים להרתיח עוד 5 דקות. מערבלים בעדינות את התמיסה כל דקה.
- לאחר הרתיחה, להעביר ~ 5 מ"ל של תרחיף חרוזים חם זה לתוך צינור מיקרו-צנטריפוגה 15 מ"ל ולמלא עם מים RT DI. צנטריפוגה ב 3,500 x גרם במשך 5 דקות, להסיר ולהשליך את supernatant.
- מעבירים עוד 5 מ"ל של תרחיף חרוזים חם ומוסיפים לחרוזים השטופים, ממלאים עוד מי DI, מערבבים היטב ושוב צנטריפוגה. חזור על הליך זה עד כ 50 מ"ל של מים DI משמש, אשר יהיה סך של 4 עד 5 פעמים שטיפה.
- מעבירים את תרחיף החרוזים לבקבוקון של 1 מ"ל. חזור על שטיפת החרוזים עם מתנול (רשימת חומרים) על ידי צנטריפוגה ב 17,000 x גרם במשך 5 דקות 3 פעמים, ולבסוף להשעות מחדש את החרוזים ב 1 מ"ל של 100% מתנול.
- תיולציה של משטח חרוזים
- לצינור צנטריפוגה של 50 מ"ל להוסיף 45.6 מ"ל מתנול, 0.4 מ"ל חומצה אצטית (רשימת חומרים), 1.85 מ"ל מי DI, 1.15 מ"ל של 3- Mercaptopropyltrimethoxysilane (MPTMS) (רשימת חומרים) ותרחיף חרוזים 1 מ"ל מוכן ב 2.1, ולאחר מכן לדגור ב RT במשך 3 שעות.
- לאחר התגובה, הסר את כל המגיבים על ידי שטיפתם פעם אחת עם מתנול טרי, והשהה מחדש את החרוזים לתוך 500 μl של מתנול. חלקו באופן שווה את מתלה חרוזי הזכוכית המרוכז הזה לקבוצה של 20 בקבוקוני זכוכית יבשים ונקיים עם מכסי בורג. התאדו מהמתנול באמצעות סילון של ארגון יבש וסובבו לאט את הבקבוקונים כדי ליצור שכבה דקה של חרוזים יבשים בצידי כל בקבוקון.
- הכניסו את בקבוקוני החרוזים לתנור ייבוש שחומם מראש לטמפרטורה של 120°C למשך 5 דקות ולאחר מכן הוציאו והניחו במהירות את הפקקים. מניחים את הבקבוקונים במייבש ואקום מזכוכית מלא בחומרי ייבוש בתחתית ושואבים את מייבש האבק עם משאבת ואקום עד לקירור.
- נקו את מייבש האבק בארגון יבש כדי להביא את המייבש ללחץ אטמוספרי רגיל. הסירו את מכסה מייבש הייבוש והדקו מחדש במהירות את הפקקים שעל הבקבוקון. אטמו את הבקבוקונים בסרט פרפין מפלסטיק ואחסנו אותם ב-RT בקופסת אחסון יבשה וחשוכה.
- בשימוש מיידי, יש לקחת בקבוקון אחד של חרוזים יבשים ולשטוף פעם אחת עם חיץ פוספט (רשימת חומרים), להשהות מחדש לתוך 50 μl של מאגר פוספט, ולאחסן ב 4 ° C. הכנת חרוזים מרוכזת זו תיקרא "חרוזי MPTMS" בשלבים הבאים.
הערה: עם אחסון מתאים, חרוזי MPTMS יכולים להישאר פונקציונליים עד שלושה חודשים.
3. פונקציונליות חרוזים
- ציפוי קוולנטי של חלבונים על חרוזים
- קח נפח מסוים (למשל, 2.5 מיקרוליטר) של ציר החלבונים וערבב אותו עם נפח שווה של חיץ פחמתי/ביקרבונט כדי ליצור תמיסה 1.
הערה: הנפח תלוי בריכוז המלאי ובצפיפות האתר הסופית הרצויה של החלבון על פני השטח של החרוזים.
- בכד קטן שוקלים 2-3 מ"ג של מקשר MAL-PEG3500-NHS (רשימת חומרים) וממיסים אותו עם חיץ פחמתי/ביקרבונט כדי להגיע לריכוז סופי של 0.231 מ"ג/מ"ל.
- ערבבו את פתרון 1 עם נפח שווה של תמיסת המקשר שהוכנה ב- 3.1.2. דגרו על התערובת ב-RT במשך 30 דקות כדי ליצור תמיסה 2.
- בינתיים, מניחים את בקבוק המקשר עם פקק משוחרר במייבש ואקום מזכוכית מלא בחומרי ייבוש בתחתית ושואבים למשך 5 דקות, וממלאים את המייבש בארגון. הדקו את הפקק והוציאו את הבקבוק. אטמו את הבקבוק בסרט פרפין מפלסטיק, הכניסו אותו למיכל מלא בחומרי ייבוש בתחתית, ואחסנו בטמפרטורה של -20°C.
הערה: השלבים הכרוכים בשימוש במקשר MAL-PEG3500-NHS, כולל 3.1.2-3.1.4 (למעט הדגירה ב- 3.1.3), צריכים להתבצע מהר ככל האפשר.
- ערבב 5 μl של חרוזי MPTMS עם תמיסה 2 והוסף חיץ פוספט (רשימת חומרים) כדי ליצור נפח סופי של 250 μl.
- לדגור על החרוזים למשך הלילה ב-RT, לשטוף 3 פעמים עם חיץ פוספט, ולהשהות מחדש לתוך 100 μl של חיץ פוספט, ולאחסן ב 4 ° C.
- הכנת חרוזים מצופים חלבון/סטרפטווידין (SA)
- עקוב אחר פרוטוקול 3.1.1-3.1.4.
- ערבב 5 μl של חרוזי MPTMS עם תמיסה 2 ו 5 μl של 4 מ"ג / מ"ל Streptavidin-Maleimide (SA-MAL) (רשימת חומרים) פתרון ולאחר מכן להוסיף חיץ פוספט כדי ליצור נפח סופי של 250 μl.
- לדגור את החרוזים לילה ב RT, לשטוף 3 פעמים עם חיץ פוספט, ולבסוף להשהות מחדש לתוך 100 μl של חיץ פוספט ולאחסן ב 4 ° C.
- ציפוי סטרפטווידין על חרוזי זכוכית
- יש לערבב 5 μl של חרוזי MPTMS עם 5 μl של תמיסת SA של 4 מ"ג/מ"ל ולהוסיף 140 μl של מאגר פוספט.
- לדגור על החרוזים למשך הלילה ב- RT, לשטוף 3 פעמים עם חיץ פוספט, להשהות מחדש לתוך 50 μl של חיץ פוספט, ולאחסן ב 4 ° C.
- ציפוי חרוזים מצופים חומצה סליצילית בחלבון ביוטינילציה
- ערבבו 5 μl של חרוזים מצופים SA עם החלבון (נפח בהתאם לצפיפות הציפוי הרצויה) והוסיפו חיץ פוספט כדי שהנפח הסופי יהיה 100 μl.
- יש לדגור על התערובת למשך הלילה בטמפרטורה של 4°C או למשך 3 שעות ב-RT, לשטוף 3 פעמים עם חיץ פוספט, ולהשהות מחדש לתוך מאגר פוספט של 50 μl ולאחסן בטמפרטורה של 4°C.
4. הכנת תאים
הערה: כדי לטהר את התאים, פעל לפי פרוטוקולי טיהור תאים סטנדרטיים המתאימים לסוג התאים שבשימוש, לדוגמה, תאי T או קווי תאים מסוימים.
- עבור ניסויי fBFP, לאחר הכנת תרחיף התא, הוסף את Fura2-AM (רשימת חומרים) מומסים ב- DMSO לתרחיף התא כדי להגיע לריכוז סופי של 2 מיקרומטר, דגור במשך 30 דקות ב- RT, ולאחר מכן שטוף פעם אחת. יש לשמור את מתלה התאים הטעון פלואורסצנטית זה בחושך עד לשימוש.
5. הכנה למיקרופיפטות ותא תא
- הכנת מיקרופיפטות
- חותכים צינורות זכוכית נימיים ארוכים (רשימת חומרים) עם חותך זכוכית לחתיכות קצרות באורך של כ -10 ס"מ. הרכיבו חתיכה אחת על מושך המיקרופיפטה (רשימת חומרים), לחצו על כפתור "משוך" כך שאמצע הנימים יחומם על ידי המכונה והנימים יימשכו בשני הקצוות כדי ליצור שני נימים עם קצוות חדים (מיקרופיפטות גולמיות).
הערה: על ידי ביצוע הנחיות המוצר, המורפולוגיה הרצויה של פיפטה גולמית יש 6-8 מ"מ taper ו 0.1-0.5 מיקרומטר קצה.
- הרכיבו פיפטה גולמית על מחזיק הפיפטה של המיקרופיפטה (רשימת חומרים). מחממים כדי להמיס את כדור הזכוכית על המזלג. הכניסו את קצה הפיפטה הגולמית לתוך כדור הזכוכית. מצננים את כדור הזכוכית ומושכים את הפיפטה הגולמית כדי לשבור אותה מבחוץ ולהשאיר את קצהו בתוך הכדור. חזור על הליך זה עד לקבלת פתח החוד הרצוי.
הערה: דוגמאות לקוטר פנימי של קצה מיקרופיפטה: 2.0-2.4 מיקרומטר עבור RBC, ~ 1.5 מיקרומטר עבור חרוז, ~ 2-4 מיקרומטר עבור תא T, ו -7 מיקרומטר עבור תא היברידי.
- בניית תא תא
הערה: תא התא בנוי על בסיס מחזיק תא תוצרת בית, המורכב משתי חתיכות של ריבועי מתכת (נחושת/אלומיניום) וידית המקשרת ביניהם (איור 1D).
- חתכו מכסה בגודל 40 מ"מ x 22 מ"מ x 0.2 מ"מ באמצעות חותך זכוכית לשתי חתיכות בגודל 40 מ"מ x 11 מ"מ x 0.2 מ"מ (כיסויים 1 ו-2). הדבק מכסה 1 באמצעות גריז לצד העליון של מחזיק התא באופן שהוא מגשר בין שני ריבועי המתכת, ובאופן דומה דבק מכסה 2 לצד התחתון, אשר ייצור תא מקביל מכסה (איור 1D).
- השתמש פיפטה כדי להזריק 200 μl של חיץ ניסיוני בין שני coverslips. ודא שהמאגר מתחבר לשני הכיסויים. סובבו ונערו בעדינות את התא כדי לאפשר למאגר לגעת בשני קצוות החדר.
- יש להזריק בזהירות שמן מינרלי לשני צידי התא הצמוד לאזור החיץ הניסיוני ובכך לאטום את החיץ מהאוויר הפתוח. הזריקו מתלים של חרוזי בדיקה (לדוגמה, חרוזים מצופים pMHC), RBCs ומטרות (לדוגמה, תאי T) באזורים העליונים, האמצעיים והתחתונים של אזור החיץ בהתאמה.
4. ניסוי BFP
- הפעל את המיקרוסקופ (רשימת חומרים) ואת מקור האור. הניחו את התא על במת המיקרוסקופ הראשית (איור 1A, D).
- התקינו את כל שלושת המיקרופיפטות של BFP (איור 1D. משמאל: גשוש, לתפוס RBC, ימין: מטרה, לתפוס תא או חרוז, למטה מימין: עוזר, לתפוס חרוז).
- השתמש במיקרו-מזרק (רשימת חומרים) כדי למלא מיקרופיפטה במאגר ניסיוני. הסירו את מחזיק הפיפטה (רשימת חומרים) והחזיקו אותו במקום נמוך יותר כדי לאפשר למים לטפטף מהקצה. הכניסו במהירות את המיקרופיפטה לקצה המחזיק וודאו שלא נכנסה בועת אוויר למיקרופיפטה במהלך ההחדרה. הדקו את בורג המחזיק.
- הרכיבו כל מחזיק פיפטה על המיקרו-מניפולטור המתאים לו. דחפו את המיקרופיפטה לכיוון התא כך שהקצוות שלהם ייכנסו לאזור החיץ של החדר. התאם את מיקום המיקרפיפטה ומצא אותם מתחת לשדה הראייה של המיקרוסקופ.
- הסתובבו סביב במת מחזיק התא כדי למצוא את המושבות של שלושה אלמנטים (RBCs, המטרות וחרוזי הגשושית) בזה אחר זה. התאם את המיקום של המיקרופיפטה המתאימה על ידי סיבוב הידיות של המניפולטורים כדי לאפשר לקצה המיקרופיפטה להתקרב לתא / חרוז אחד. שאפו את התא/חרוז על ידי התאמת הלחץ בתוך המיקרופיפטה המתאימה. כל שלושת micropipettes יהיה ללכוד את האלמנטים המתאימים שלהם.
- הסתובבו סביב במת מחזיק התא כדי למצוא חלל פתוח הרחק מהמושבות של האלמנטים המוזרקים שבהם יבוצע הניסוי. החלף את המצב החזותי של המיקרוסקופ כדי להמחיש את התמונה בתוכנית המחשב על מסך המחשב. העבר את כל שלושת האלמנטים על קצות פיפטה לשדה הראייה של התוכנית.
- יישרו את חרוז הגשושית ואת RBC, ותמרנו בזהירות את חרוז הגשושית לקודקוד ה-RBC, פגעו לרגע בחרוז על ה-RBC ונסוגו בעדינות. התאימו את הלחץ של המיקרופיפטה המסייעת כדי להעיף בעדינות את החרוז, כך שהוא יישאר מודבק על קודקוד RBC (איור 1F). הרחיקו את המיקרופיפטה המסייעת ויישרו את המטרה ואת חרוז הגשושית (איור 2A).
- בתוכנית, בחלון שדה הראייה השתמש בכלים בתוכנית כדי למדוד את הרדיוסים המתאימים של מיקרופיפטה בדיקה (Rp), RBC (R0), אזור המגע המעגלי בין RBC וחרוז בדיקה (Rc ), המאפשר להעריך את קבוע הקפיץ של RBC (k) על ידי המשוואה הבאה, כאשר Δp הוא לחץ השאיפה בקצה פיפטת הבדיקה. הערה: מחוק הוק נובע שניתן לכמת את הכוח המחייב, F, על ידי מכפלת קבוע הקפיץ והתזוזה של חרוז הגשושית (d), כלומר F = d (איור 2C).
- הזן את קבוע קפיץ RBC הרצוי לתוכנית (עיין בסעיף פרוטוקול 4.6. קבוע הקפיץ נקבע בדרך כלל על 0.25 או 0.3 pN/nm עבור בדיקת מהדק הכוח ותדירות ההדבקה ו- 0.1 pN/nm עבור בדיקת התנודות התרמיות), אשר יחזיר לחץ שאיפה נדרש ביחידת סנטימטר מים. התאימו את גובה מיכל המים המתחבר לפיפטה של הגשושית עד להגעה ללחץ השאיפה הנדרש.
- צייר קו אופקי לרוחב קודקוד RBC, שיניב עקומה בחלון הסמוך המציינת את הבהירות (ערך גווני אפור) של כל פיקסל לאורך קו זה. גררו את קו הסף כך שיהיה בערך מחצית מעומק העקומה (איור 2A, B).
הערה: נקודת המינימום בעקומת הבהירות מתחת לקו הסף מציינת את מיקום גבול החרוז, ולכן מותר רק מינימום מקומי אחד. אם קיימות כיום שתי מינימות מקומיות או יותר, הדבר מצביע על כך שהתמונה אינה אופטימלית (ככל הנראה בגלל שהתמונה אינה ממוקדת, או יישור לקוי בין חרוז הגשושית ל-RBC).
- בחר את מצב הניסוי הרצוי: בדיקת תנודות תרמיות, בדיקת תדירות הידבקות או בדיקת מהדק כוח. הגדר את הפרמטרים כרצונך (למשל, כוח פגיעה = 15 pN, קצב טעינה = 1,000 pN/s, זמן מגע = 1 שניות, כוח הידוק = 20 pN (לבדיקת מהדק כוח) וכו ').
- לחץ על "התחל", המאפשר לתוכנית להזיז את פיפטת המטרה ולהניע את המטרה פנימה והחוצה ממגע עם הגשושית (ראה סעיף תוצאות מייצגות לפרטים). איסוף הנתונים יתבצע במקביל, אשר מתעד את מיקום חרוז הבדיקה בזמן אמת. עצור את התוכנית על ידי לחיצה על כפתור "עצור ניסוי", ואז חלון יצוץ החוצה כדי לאפשר שמירת הנתונים שנרכשו.
