מבחן מחייב תחרות לחקר שותפי חלבון קושרי GTPase מתחרים

תקציר

מקור: Williamson, R. C., et al. השוואת הזיקה של חלבונים קושרי GTPase באמצעות מבחני תחרות. J. Vis. Exp. (2015)

סרטון זה מדגים מבחן תחרות לחקר שותפי חלבון קושרי GTPase. באמצעות שימוש בחלבון GTPase הקשור לנוקלאוטידים המשותק על חרוזים מגנטיים, ניתן לחקור את הקישור התחרותי בין שני שותפי חלבון המקיימים אינטראקציה עבור אותו אתר קישור ב- GTPase כדי להעריך את זיקות הקישור של שותפי החלבון.

פרוטוקול

1. טיהור GTPase עם תג GST

1. תרבית זן E. coli כגון BL21 שעבר טרנספורמציה עם pGEX-Rac1 O/N ב-37°C, רועד ב-220 סל"ד, ב-500 מ"ל של מדיה אינדוקציה אוטומטית (25 mM Na₂HPO₄, 25 mM KH₂PO₄, 50 mM NH₄Cl, 5 mM Na₂SO₄, 2 mM MgSO₄, 2 mM CaCl₂, 0.5% גליצרול, 0.05% גלוקוז, 0.2% לקטוז, 5 גרם טריפטון, 2.5 גרם תמצית שמרים, 100 מיקרוגרם/מ"ל אמפיצילין).
2. קצור חיידקים על ידי צנטריפוגה במשך 10 דקות ב 10,000 x גרם, 4 ° C.
3. יש להשהות את כדורית החיידקים בריאגנט מיצוי חלבונים של 20 מ"ל, מעכב פרוטאז 1x, ולדגור במשך 20 דקות ב-RT עם היפוך.
4. להבהיר את הליזט על ידי צנטריפוגה ב 40,000 x גרם במשך 30 דקות.
5. הוסף 2 מ"ל חרוזים מגנטיים של גלוטתיון, שטופים במי מלח חוצצי פוספט (PBS: 10 mM Na₂HPO₄, 1.8 mM KH₂PO₄, 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl).
6. לדגור במשך 2 שעות, ערבוב על ידי היפוך ב 4 ° C.
7. שטפו חרוזים עמוסי חלבון ארבע פעמים עם PBS של 10 מ"ל, באמצעות ממיין חלקיקים מגנטי כדי לזרז את החרוזים בכל שלב.
8. יש להשהות חרוזים עמוסי חלבון ב-PBS של 2 מ"ל ולאחסן בטמפרטורה של -80°C ב-100 μl aliquots עד לצורך.

2. ביטוי חלבונים קושרי GTPase

1. יום לפני הניסוי, פלסמידים טרנספקטים המקודדים את החלבון הפלואורסצנטי הירוק (GFP) - גרסאות מתויגות של כל חלבון קושר GTPase לתוך בקבוק^{נפרד של 75} ס"מ 2 של HEK293T כדלקמן. לאימות של טעינת נוקלאוטידים, העבר את TrioD1 המתויג GFP לבקבוק שלישי בגודל 75 ס"מ^{של 2} HEK293T.
   1. לדלל פוליאתילאמין ל 1 מ"ג / מ"ל ב 100 μl סטרילי 150 mM NaCl.
   2. הוסף 27 μl פוליאתילאמין מדולל ל 223 μl מדיה מופחתת בסרום.
   3. הוסף 12 מיקרוגרם DNA פלסמיד ל 250 μl מדיה מופחתת בסרום.
   4. דגרו על כל צינור למשך 2 דקות ב-RT.
   5. ערבבו את תערובות הפוליאתילאמין והדנ"א בצינור בודד ובמערבולת אחת למשך 2 דקות.
   6. יש לדגור במשך 15-20 דקות ב-RT.
   7. יש להחליף את מצע הגדילה (Dulbecco's Modified Eagle Media, 10% נסיוב בקר עוברי, 2 מ"מ L-גלוטמין, ללא אנטיביוטיקה) ב-90% HEK293T במצע גדילה טרי של 5 מ"ל.
   8. הוסף את תערובת הפוליאתילאמין/DNA המשולבת לבקבוק ודגור O/N ב 37 ° C, 5% CO₂.

3. טיהור חלבונים קושרי GTPase

1. יש לשטוף צלוחיות של תאים נגועים ב-PBS ולנקז את הבקבוק למשך 5 דקות, תוך שאיפת נוזלים חופשיים.
2. יש לגרד תאים במאגר ליזה של 500 μl (50 mM Tris-HCl (pH 7.8), 1% Nonidet P-40, 1x מעכב פרוטאז) לתוך צינור מיקרופוגה.
3. תאי ליז על ידי ערבוב על ידי היפוך ב 4 ° C במשך 30 דקות.
4. במהלך הליזיס, שטפו שלוש פעמים שתי מנות של חרוזי מלכודת GFP-Trap של 40 מיקרוליטר עם חיץ ליזיס טרי, ושיקעו חרוזים במהירות של 2,700 x גרם למשך 2 דקות בין השטיפות.
5. להבהיר lysates על ידי צנטריפוגה ב 21,000 x גרם במשך 10 דקות.
6. העבירו ליזט מובהר של כל אחד מהחלבונים המתחרים כדי להפריד חרוזי מלכודת GFP שטופים ולאפשר לחלבוני היתוך GFP להיקשר במשך שעתיים, תוך ערבוב בהיפוך של 4°C. שמרו ליזט מתאי GFP-TrioD1 על קרח.
7. יש לשטוף חרוזי מלכודת GFP טעונים פעמיים ב-50 mM Tris-HCl (pH 7.8), 50 mM NaCl, 0.7% (w/v) Nonidet P-40 ופעמיים ב-50 mM Tris-HCl (pH 7.6), 20 mM MgCl₂, שקיעת חרוזים ב-2,700 x גרם למשך 2 דקות בין כביסה.
8. יש למרוח חלבוני היתוך GFP על ידי הוספת 40 μl 0.2 M גליצין (pH 2.5) ופיטום מעלה ומטה במשך 30 שניות. מיד למרוח חרוזי משקעים ב 21,000 x גרם במשך 60 שניות ולהעביר נוזל לצינור מיקרופוגה חדש המכיל 4 μl 1 M Tris-HCl (pH 10.4). עשו זאת במהירות כדי לצמצם את הנזק לחלבון המטוהר.
9. לנתח 1 μl של כל חלבון מטוהר על ידי כתם מערבי ולבדוק עם נוגדן anti-GFP כדי לקבוע תפוקה יחסית באמצעות מערכת blotting כמותית על פי פרוטוקול היצרן. לחלופין, לקבוע ריכוזי חלבונים על ידי בדיקת חומצה ביכומונית (BCA), אך הדבר יוצר טעויות אם החלבונים אינם מגיבים עם הבדיקה באופן זהה או אם ישנם חלבונים מזהמים.
10. להשוות את ריכוז החלבון המולרי על ידי תוספת של 50 mM Tris-HCl (pH 7.6) ו 20 mM MgCl₂.

4. טעינת נוקלאוטידים של GTPase

1. הפשיר aliquot אחד של חרוזים מגנטיים GST-Rac1, מוכן בשלב 1.
2. קח 90 μl של חרוזי GST-Rac1 ושטוף שלוש פעמים עם 20 mM Tris-HCl (pH 7.6), 25 mM NaCl, 0.1 mM DTT ו- 4 mM EDTA, באמצעות ממיין חלקיקים מגנטי כדי לזרז את החרוזים בכל שלב.
3. יש לשאוף חיץ מחרוזים ולהוסיף 100 μl 20 mM Tris-HCl (pH 7.6), 25 mM NaCl, 0.1 mM DTT ו-4 mM EDTA.
4. בהתאם לשאלה האם נדרש תמ"ג, GTP או לא העמסת נוקלאוטידים לניסוי התחרות, יש להוסיף 12 μl 100 mM GDP, 12 μl 10 mM guanosine 5'-[γ-thio]triphosphate (GTPγS) או ללא נוקלאוטיד לחרוזי 60 μl GST-Rac1.
5. עבור פקדי טעינת הנוקלאוטידים, פצלו את החרוזים הנותרים לשלושה אליציטוטים של 10 מיקרוליטר והוסיפו 2 μl 100 mM GDP, 2 μl 10 mM GTPγS או ללא נוקלאוטיד לכל צינור.
6. דגירה על ערובות חרוזים במשך 30 דקות ב-30°C עם תסיסה.
7. ייצוב Rac1 הקשור לנוקלאוטידים על ידי תוספת של 1 M MgCl₂: 3 μl לתערובת הניסוי (שלב 4.4), ו-0.5 μl לכל אחת מתערובות הבקרה (שלב 4.5).

5. תחרות מחייבת

1. הגדר 6 צינורות מיקרופוגה, שכל אחד מהם מכיל:
   200 μl 50 mM Tris-HCl (pH 7.6), 20 mM MgCl₂
   10 μl חרוזי Rac1 ניסיוניים טעונים בנוקלאוטידים (משלב 4.7)
   5 μl חלבון קושר Rac1 A (חלבון קושר קבוע)
2. לכל צינור, הוסף 0, 1, 2.5, 5, 10 או 20 μl חלבון קושר Rac1 B (חלבון קושר משתנה). נפחים אלה מניחים ריכוזי מלאי שווים בקירוב של חלבוני הקישור הקבועים והמשתנים וייתכן שיהיה צורך להתאים אותם.
   1. התאימו נפחים של חלבונים קושרים A ו-B אם יש הבדלים גדולים בזיקות הקישור של שני החלבונים ויש לקבוע זאת אמפירית באמצעות חזרות הניסוי. לפצות את הנפח הכולל של תערובת מחייב ל 235 μl על ידי תוספת של 50 mM Tris-HCl (pH 7.6), ו 20 mM MgCl₂.
3. הגדר צינור מיקרופוגה המכיל:
   200 μl 50 mM Tris-HCl (pH 7.6), 20 mM MgCl₂
   10 μl חרוזי Rac1 ניסיוניים טעונים בנוקלאוטידים (משלב 4.7)
   10 μl חלבון קושר Rac1 A (חלבון קושר קבוע)
4. הגדר את GDP, GTPγS, וללא צינורות בקרת נוקלאוטידים:
   200 μl 50 mM Tris-HCl (pH 7.6), 20 mM MgCl₂
   בקרת 10 μl חרוזי Rac1 נטענים בשלב 4.5 עם GDP, GTPγS או ללא נוקלאוטיד ומתייצבים בשלב 4.7.
   180 μl HEK293T GFP-TrioD1 lysate, מוכן כמו בשלב 3.6
   4 μl 1 M MgCl₂
5. לדגור על התערובת במשך 2 שעות, ערבוב על ידי היפוך ב 4 ° C.
6. שטפו את החרוזים שלוש פעמים עם 50 mM Tris-HCl (pH 7.6), ו-20 mM MgCl₂.
7. חלבונים הקשורים לפליטה ב-20 μl חיץ דגימה מקטין (50 mM Tris-HCl (pH 7), 5% SDS, 20% גליצרול, 0.02 מ"ג/מ"ל ברומופנול כחול, 5% β-מרקפטואתנול).

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
שובר באגים	נובאגן	70584-3
מעכב פרוטאז מלא	רוש	05 056 489 001
חרוזים מגנטיים של גלוטתיון	פירס	88821
פוליאתילן, מסועף, ממוצע Mw ~ 25,000	סיגמא אולדריץ'	408727-100 מ"ל
אופימם	לייף טכנולוגיות	31985-047
מדיית הנשר השונה של דולבקו	סיגמא אולדריץ'	D5796
סרום בקר עוברי	לייף טכנולוגיות	10270-1-6
ל-גלוטמין	לייף טכנולוגיות	25030-024
GFP-Trap_A	כרומוטק	GTA-20
תמ"ג	סיגמא אולדריץ'	G7127	מאוד לא יציב. Aliquot ולאחסן ב -80 מיד עם החוקה מחדש
GTPγS	סיגמא אולדריץ'	G8634	מאוד לא יציב. Aliquot ולאחסן ב -80 מיד עם החוקה מחדש
מאגר חוסם	סיגמא אולדריץ'	B6429
טווין-20	סיגמא אולדריץ'	P9416
נוגדן נגד GFP	צבעים חיים	632592	יש להשתמש בדילול של 1/1000
DyLight 800 נוגדן משני מצומד נגד ארנב	פישר סיינטיפיק	10733944
מערכת הדמיה אינפרא אדומה Odyssey SA	לי-קור	9260-11PC