בדיקת מיקרו-מערך אנטיגן נגיפי לאיתור איזוטיפים של נוגדנים בסרום נגד אנטיגן נגיפי

תקציר

מקור: Khan, S., et al., שימוש במיקרו-מערך אנטיגן שפעת למדידת רוחב הנוגדנים בסרום על פני תת-סוגים של וירוסים. J. Vis. Exp. (2019)

בסרטון זה אנו מדגימים את התהליך לאיתור איזוטיפים של נוגדנים במספר דגימות נסיוב אנושי באמצעות שקופית microarray המודפסת עם תת-סוגים אנטיגניים של זני נגיפי שפעת.

פרוטוקול

1. לייצר מיקרו-מערכים אנטיגן שפעת

1. הדפסת אנטיגנים על שקופיות microarray
   1. יש להחזיר כל אנטיגן שעבר ליופיליזציה לריכוז של 0.1 מ"ג/מ"ל במי מלח חוצצי פוספט (PBS) עם 0.001% Tween-20 (T-PBS). העבר 10 μL של כל אנטיגן משוחזר לבארות בודדות של צלחת שטוחה 384 בארות לא מטופלות.
   2. הדפס אנטיגנים באמצעות מדפסת microarray עם פיני איתור microarray בנפח נמוך השואפים אנטיגן לתוך ערוץ הדגימה ומפקידים באמצעות מגע ישיר ופעולה נימית על שקופיות זכוכית מצופות ניטרוצלולוז 16 פד.
      1. תכנת את תוכנת ההדפסה (לדוגמה, Gridder) עם תצורת לוח המקור ופרמטרי ההדפסה.
         1. השתמש בתפריט הנפתח כדי לבחור את שם סוג הלוח שישמש בשיטת הדפסה זו. עבור מחקר זה, השתמש צלחת שטוחה 384 באר לא מטופלת.
         2. בחר בתיבת הטקסט לצד מספר לוחות והקלד את מספר הלוחות לדוגמה שישמשו בפרוטוקול הדפסה זה. במחקר זה, השתמש בצלחת אחת.
         3. בחר תצורת סיכה לשימוש בשיטה זו. במחקר זה, השתמש בתצורה של 8 פינים.
         4. ודא שהיסטות המקור הן המרחקים (בכיווני X ו- Y) בין מקור השקופית (המכויל במקטע ניהול) לבין המיקום שבו יתחילו להדפיס את פיני ההדפסה על השקופיות.
         5. באמצעות הכרטיסיה Array Design, הגדר את הגודל והצורה של המערכים (מרווח בין נקודות ומספר הנקודות בכל subarray). לצורך מחקר זה, הדפס 324 כתמים (קוטר 180 מיקרומטר עם מרווח של 300 מיקרומטר) על שקופיות של 16 פדים בפורמט 18x18 באמצעות 8 פינים.
         6. בחר את הפרמטרים עבור האופן שבו פיני ההדפסה אוספים ומחלקים דוגמאות. במחקר זה, כל סיכה שואפת 250 nL של תמיסת אנטיגן ומדפיסה 1 nL על כל אחד מ-40 כתמים (סה"כ 20 שקופיות לכל 8 הפינים)
         7. הגדר את פרוטוקול ניקוי הפינים ואת פרוטוקול ההכתמה. במחקר זה, כל סיכה מדפיסה אנטיגן טובלת ב- ddH₂O סטרילי במיכל שטיפה סוני ולאחר מכן שואפת את האנטיגן הבא.
         8. הגדר את הרצף שבו הבלוקים לדוגמה יודפסו על השקופיות. תוכנת המערך תבנה קובץ אינדקס רשת מבואר ( .gal) כדי לתאר את סידור האנטיגנים בתוך כל microarray.
            הערה: השורה העליונה משמשת לפידוקיאלים (עם פלואורסצנטיות בכל אורכי הגל המשמשים בהדמיה, למשל, שילוב של Qdot 585 nm streptavidin conjugate ו-Qdot 800 nm streptavidin conjugate במחקר זה) כדי לכוון רשתות במהלך ההדמיה. עבור ריצות הדפסה ארוכות, אנטיגנים בלוח המקור יכולים להיות מושהים מחדש מעת לעת על ידי צנרת למעלה ולמטה ולאחר מכן צנטריפוגה, או לוח מקור חדש ניתן להכין ולהשתמש בו.
   3. הניחו שקופיות microarray שלא נבדקו בקופסה חסינת אור ושמרו אותן בארון מייבש בטמפרטורת החדר לאחסון לטווח ארוך.
      הערה: הפרוטוקול עשוי להיות מושהה ללא הגבלת זמן בשלב זה.
2. בצע בדיקת בקרת איכות (דורש תגי פולי-היסטידין)
   1. חברו את השקופית לתאי חיטוט והתייבשו מחדש באמצעות מאגר חוסם כמתואר בשלבים 2.1.1-2.1.2 ומוצג באיור 1.
   2. לדלל את העכבר חד שבטי poly-נוגדן שלו 1:100 במסנן 1x חוסם buffer.
      הערה: אם אנטיגנים חלבוניים לא מטוהרים (למשל, מבוטא במערכת שעתוק ותרגום חוץ גופי) משמשים ישירות להדפסת מיקרו-מערכים, הוסף רכיבים של מערכת ביטוי החלבונים (למשל, E. coli lysate) ביחס של 1:10 עם המאגר החוסם המשמש לדילול בסרום על מנת לחסום נוגדנים המכוונים נגד רכיבים אלה.
   3. יש להוסיף 100 μL של נוגדן פולי-His מדולל לכל תא שקופיות המכיל את משטח המערך לאחר השאיפה ולדגור במשך שעתיים בטמפרטורת החדר או לילה ב-4°C על שייקר. שטף 3x עם מאגר T-TBS כמתואר בשלב 2.2.1. לדלל נוגדן משני מסוג IgG נגד עכבר נגד עכבר בביוטין 1:200 בחיץ חוסם, להוסיף 100 μL לבאר לאחר השאיפה, ולדגור במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר על שייקר. שטפו 3x עם מאגר T-TBS.
   4. לדלל Qdot 585 ננומטר סטרפטאווידין מצומדים ל 4 ננומטר בחיץ חוסם, להוסיף 100 μL לכל באר לאחר השאיפה, ולדגור במשך 1 שעה בטמפרטורת החדר על שייקר. שטף 3x עם מאגר T-TBS, ולאחר מכן פעם אחת עם מאגר TBS (ללא Tween).
   5. פירוק וכימות שקופיות כמתואר בשלבים 2.2.5 – 3.1.2.
      הערה: אנטיגנים חלבוניים חייבים להכיל תגי His10 כדי להשתמש בפרוטוקול בקרת איכות זה. לחלופין, אם נכלל תג אחר, ניתן לבצע בדיקת בקרת איכות עם נוגדן או ליגנד לתג זה.

2. בדיקת סרה לנוגדנים לשפעת באמצעות מיקרו-מערכים

1. לדגור סרה על מיקרו-מערכים לקשירת נוגדנים.
   1. חבר שקופיות microarray לתאים באמצעות קליפסים ומקם אותן במסגרות כפי שמוצג באיור 2.
      הערה: הימנע תמיד מלגעת במשטח המיקרו-מערך עם ידיים ומכשירים. ודא שהשקופיות מכוונות עם צד הפד כלפי מעלה והחריץ הקטן בפינה הימנית העליונה.
   2. התייבשו שקופיות microarray עם 100 μL לכל באר של חיץ חוסם 1x מסונן, וסרום לדלל 1:100 ב 100 μL של חיץ חוסם (יכול להשתמש לוחות 96 באר לא מטופלים או צינורות 2 מ"ל). יש לדגור הן על שקופיות מיקרו-מערך מיובשות במסגרות מכוסות והן על סרה מדוללת בנפרד למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר על שייקר מסלולי במהירות 100-250 סל"ד. בצע את כל שלבי הדגירה הבאים באופן דומה על השייקר.
      הערה: יש לערבב ולהקפיא את Sera בטמפרטורה של -80°C לאחסון לטווח ארוך כדי למזער את מחזורי ההקפאה-הפשרה, ויש לערבל אותו כדי לערבב אותו ולצנטריפוגה כדי להסיר חלקיקים לפני השימוש. התבונן היטב בתאי שקופיות במהלך שלב זה ולאחריו כדי לזהות כל דליפה הדורשת הרכבה מחדש של תאי שקופיות.
   3. בעזרת קצוות פיפטה המחוברים לקו ואקום עם צלוחיות איסוף משניות, שאפו בזהירות את חיץ החסימה מפינת כל תא מבלי לגעת ברפידות. בצע את כל שלבי השאיפה הבאים באופן דומה. הוסיפו סרה מדוללת לפדים במהירות לאחר השאיפה כדי לא לאפשר לפדים להתייבש.
   4. הניחו מסגרות מכוסות במגשים בתוך מיכל משני מוקף במגבות נייר לחות ואטום למניעת אידוי. יש לדגור לילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס על שייקר נדנדה (לחילופין, ניתן לדגור במשך שעתיים בטמפרטורת החדר על שייקר מסלולי ב-100-250 סל"ד).
2. נוגדנים בסרום קשור תווית עם נוגדנים משניים מצומדים קוונטיים-נקודה
   1. יש לשאוף סרה מהתאים בזהירות כמתואר לעיל, להוסיף 100 μL לכל באר של חיץ T-TBS (20 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 0.05% Tween-20 in ddH₂O מותאם ל-pH 7.5 ומסונן, ניתן להשיג באופן מסחרי), ולדגור במשך 5 דקות על שייקר מסלול ב-100-250 סל"ד. חזור על שלב כביסה זה בסך הכל 3x (כל שלבי השטיפה הבאים מבוצעים באופן דומה).
   2. הכינו תערובת של נוגדנים משניים מדוללים ל-1 מיקרומטר בחיץ חוסם וערבבו היטב על ידי פיפטינג לפני ובמהלך השימוש כדי לשמור על הומוגניות.
      הערה: כדי לשמור על יכולת השחזור של הבדיקה, יש להשתמש באותה אצווה של כל נוגדן משני לכל ניסויי החיטוט שעבורם מתוכננת השוואה כמותית של נתונים בין ניסויים. ייתכן שיהיה צורך לשנות את הריכוז הספציפי של נוגדן משני בהתאם לזיקה; פעל בהתאם לפרוטוקולים של היצרן כאשר הם זמינים.
   3. יש לשאוף חיץ מהתאים לאחר השטיפה הסופית, להוסיף 100 מיקרוליטר לבאר של תערובת נוגדנים משנית, ולדגור במשך שעתיים בטמפרטורת החדר על שייקר.
   4. לשאוף תערובת נוגדנים משנית לשטוף 3x עם חיץ T-TBS, ולאחר מכן לשטוף פעם אחת עם חיץ TBS (ללא Tween).
   5. יש לפרוק את שקופיות המיקרו-מערך מהתאים בזהירות כדי להימנע ממגע ברפידות, לשטוף בעדינות עם ddH₂O מסונן ולייבש אותן על ידי הכנסתן לצינורות של 50 מ"ל וצנטריפוגה במהירות של 500 x גרם למשך 10 דקות.
   6. הניחו שקופיות microarray בקופסה חסינת אור ושמרו אותן בארון מייבש בטמפרטורת החדר לאחסון לטווח ארוך.
      הערה: הפרוטוקול עשוי להיות מושהה עד שבוע בשלב זה.

3. כימות קשירת נוגדנים לאנטיגנים בתוך microarray

1. דמיינו שקופיות מיקרו-מערך וכמתו את עוצמת הפלואורסצנטיות הנקודתית כדי למדוד קשירת נוגדנים.
   1. קבל תמונות של שקופיות microarray באמצעות imager נייד עם תוכנה מובנית.
      1. בכרטיסיה קביעת תצורה של Imager, בחר את תצורת השקופית המתאימה. במחקר זה, השתמש בשקופיות של 16 פדים.
      2. בכרטיסייה Image Control, בחרו בערוץ הפלואורסצנטי המתאים וכווננו את הרווח, זמן החשיפה וזמן הרכישה בהתאם לתגובתיות של הסרה לקבלת תמונות מיטביות. במחקר זה, התעלות הפלואורסצנטיות עבור IgA ו-IgG היו 585 ננומטר ו-800 ננומטר בהתאמה, והגדרות ההדמיה היו רווח של 50, זמן חשיפה של 500 מילישניות וזמן רכישה של שנייה אחת.
      3. לחץ על לכידה כדי להתחיל בתהליך רכישת התמונה.
         הערה: ניתן לצלם מחדש שקופיות Microarray בהגדרות מרובות ללא פגיעה באותות כל עוד הם מאוחסנים חשוכים ויבשים. ניתן להשתמש במערכות הדמיה אחרות אם הן תואמות לשקופיות.
2. זהה נקודות מערך באמצעות רשתות שכיוונן מבוסס על הסמנים הפידוקיאליים ומדוד את עוצמת הספוט כחציון של עוצמת הפיקסלים פחות הרקע הנמדד סביב ספוטים. בצע אלגוריתם כימות זה באצווה באמצעות תוכנת ההדמיה המובנית, המשתמשת בקובץ .gal שנבנה בשלב 1.1.2 כדי לחבר עוצמות נקודתיות לאנטיגנים בודדים בכל מיקרו-מערך.
   1. בחלונית File Info, העלה את קובץ ה- .gal על-ידי בחירה מהתיקייה שלו במחשב, וציין את התיקייה שבה קובצי פלט הניתוח יישמרו במקטע Analysis Options.
   2. בכרטיסייה בקרת תמונה, פתח אחת מהתמונות שנרכשו לכימות ובחר בלחצן אוטומטי בפינה השמאלית העליונה.
   3. במקטע ניתוח מערך בפינה השמאלית התחתונה, צור תבנית fiducial בהתאם להוראות התוכנה.
   4. לחץ על ניתוח אצווה, בחר את התיקיה המכילה את התמונות שיש לכמת, ובחר את התבנית fiducial שנוצרה בשלב הקודם. התוכנה מנתחת כל תמונה ומכמתת את עוצמת הספוט.
      הערה: שלב זה ייצור קובץ .csv המכיל עוצמות נקודתיות המכמתות נוגדנים בתוך כל דגימת סרום הנקשרים לכל אנטיגן בודד במיקרו-מערך שלאחר מכן ניתן לתפעל אותו בתוכנת מניפולציה או ניתוח של גיליונות אלקטרוניים.
3. נתח נתונים גולמיים כדי להשוות קשירת נוגדנים בין אנטיגנים ובין דגימות בסרום. במחקר זה, נוגדנים מסוג IgA ו-IgG שנמדדו בעוצמות כתמים פלואורסצנטיים של 585 ננומטר ו-800 ננומטר הושוו בכל האנטיגנים בין 2 ריצות בלתי תלויות של הניסוי באמצעות שקופיות שונות בימים שונים, וניתוח מתאם בוצע כדי למדוד את יכולת השחזור של הבדיקה.
   הערה: עבור חלבונים לא מטוהרים המודפסים כתערובת ביטוי, ניתוח הנתונים צריך להתחיל עם חיסור רקע ללא בקרת DNA.

תוצאות

איור 1: סכמה של פרוטוקול הדפסה ובדיקה של מיקרו-מערך אנטיגן שפעת. משמאל לימין, מיקרו-מערך מודפס באמצעות שקופיות מצופות ניטרוצלולוז, המשמשות לבדיקת סרה עבור נוגדני IgG ו- IgA באמצעות נוגדנים משניים מצומדים לנקודות קוונטיות, עם שקופיות שצולמו באמצעות מצלמה ניידת, ותוצאות נותחו כדי ליצור מפת חום.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
מגלשות זכוכית מצופות ניטרוצלולוז עם 16 פדים	גרייס ביו לאבס	305016
1x GVS מאגר חסימה מהיר	פישר סיינטיפיק	10485356
ArrayCam מצלמה ניידת	גרייס ביו לאבס	400S	ניתן להשתמש במכשירי הדמיה אחרים כדי להמחיש שקופיות אם הם מסוגלים להשיג את הרזולוציה של נקודות המיקרו-מערך ואת אורכי גל העירור והפליטה של הנקודות הקוונטיות.
נוגדן עז מצומד ביוטין נגד עכבר-IgG	תרמו פישר	31800
HiBase 384-well	גריינר ביו-וואן	T-3037-11
סיכות Microarray	ArrayIt	GMP2	כל מדפסת microarray שונה עשויה לדרוש פיני microarray מותאמים אישית משלה.
עכבר חד שבטי פולי-הנוגדן שלו	סיגמא-אולדריץ'	H1029
OmniGrid 100	GeneMachines		גרסת מדפסת המיקרו-מערך המשמשת בעבודה זו אינה זמינה עוד מסחרית, אך הציוד הדומה המעודכן הוא מדפסת OmniGrid Accent microarray מבית Digilab (הופקינטון, מסצ'וסטס), וניתן לבצע את אותו פרוטוקול עם רוב מדפסות המיקרו-מערך הזמינות מסחרית.
ProPlate	גרייס ביו לאבס	246890
ProPlate קטעי שקופיות	גרייס ביו לאבס	204838
ProPlate	גרייס ביו לאבס	246879
Quantum dot 585 ננומטר עז מצומדת נוגדן אנטי-אנושי-IgA	גרייס ביו לאבס	110620
נקודה קוונטית 585 ננומטר סטרפטאווידין מצומד	תרמו פישר	Q10111MP
Quantum dot 800 ננומטר נוגדן עז מצומד אנטי-אדם-IgG	גרייס ביו לאבס	110610