מאמר שיטה

מיקרוסקופ TIRF להמחשת דינמיקת צימוד אקטין ומיקרוטובול

8 ביולי 2025

במאמר זה

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מקור: Henty-Ridilla, J.L., Visualizing Actin and Microtubule Coupling Dynamics In Vitro by Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) Microscopy. J. Vis. Exp. (2022)

סרטון זה מתאר את TIRF, טכניקה מבוססת מיקרוסקופיית השתקפות פנימית כוללת להמחשת דינמיקת פילמור אקטין ומיקרוטובול. השיטה מאפשרת הדמיה ברזולוציה גבוהה של דינמיקת צימוד אקטין ומיקרוטובול בזמן אמת, החיונית להבנת שיחות צולבות תאיות.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. שטיפת הכיסויים

הערה: כביסה (24 מ"מ x 60 מ"מ, #1.5) מכסה על פי Smith et al., 2013.

  1. סדרו את הכיסויים במיכל פלסטיק של דיוור שקופיות.
  2. יש לטבול את החלקות הכיסוי ברצף בתמיסות הבאות ולבצע סוניקציה במשך 30-60 דקות, לשטוף עם ddH2O 10 פעמים בין כל תמיסה: ddH2O עם טיפה אחת של סבון כלים; 0.1 M KOH. יש לאחסן כיסויים באתנול 100% עד 6 חודשים.
    הערה: אין לגעת במשטחי זכוכית באצבעות לא אהובות. השתמש במלקחיים במקום.

2. ציפוי מנוקה (24 מ"מ x 60 מ"מ, #1.5) מכסה עם mPEG- וביוטין-PEG-silane

הערה: פרוטוקול זה משתמש באופן ספציפי במערכת ביוטין-סטרפטאבידין כדי למקם אקטין ומיקרוטובולים בתוך מישור הדימות TIRF. ניתן להשתמש בציפויים ומערכות אחרות (למשל, נוגדנים, פולי-L-ליזין, מיוזין NEM וכו').

  1. הפשירו אליציטוטים של אבקות PEG-silane וביוטין-PEG-סילאן.
  2. יש להמיס אבקות PEG באתנול 80% (pH 2.0) ליצירת תמיסות מלאי ציפוי של 10 מ"ג/מ"ל mPEG-silane ו-2-4 מ"ג/מ"ל ביוטין-PEG-סילאן, ממש לפני השימוש.
    הערה: אבקות PEG נראות לעתים קרובות מומסות, אך ייתכן שאינן ברמה המיקרוסקופית. השעיה נכונה אורכת ~ 1-2 דקות עם פיפטינג קבוע. אנו מעודדים את המשתמשים לפיפטה 10 פעמים נוספות לאחר הופעת המסת אבקה.
    זהירות: יש ללבוש כפפות כדי להגן על העור מפני HCl מרוכז בעת ייצור 80% אתנול (pH 2.0).
  3. הסר את הכיסוי הנקי (24 מ"מ x 60 מ"מ, #1.5) מאחסון אתנול באמצעות מלקחיים. מייבשים עם גז חנקן ומאחסנים בצלחת פטרי נקייה.
  4. כיסויי מעיל עם 100 μL של תמיסת ציפוי: תערובת של 2 מ"ג/מ"ל mPEG-silane (MW 2,000) ו-0.04 מ"ג/מ"ל ביוטין-PEG-סילאן (MW 3,400) ב-80% אתנול (pH 2.0).
    הערה: לציפוי דליל (מומלץ) יש להשתמש ב-2 מ"ג/מ"ל mPEG-silane ו-0.04 מ"ג/מ"ל ביוטין-פג-סילאן. לציפוי צפוף יש להשתמש ב-2 מ"ג/מ"ל mPEG-סילאן, 4 מ"ג/מ"ל ביוטין-PEG-סילאן.
  5. יש לדגור על כיסויים בטמפרטורה של 70°C למשך 18 שעות לפחות או עד לשימוש.
    הערה: כיסויים מצופים מתפרקים אם מאוחסנים בטמפרטורה של 70°C למשך יותר משבועיים.

3. הרכבת תאי זרימה להדמיה

  1. חתכו 12 רצועות של סרט דו-צדדי בעל גב כפול לאורך של 24 מ"מ. הסירו צד אחד של גב הסרט וקיבעו פיסות סרט הדבקה הסמוכות לששת החריצים הקיימים בתא הדמיה נקי.
    הערה: סרט הדבקה חייב להיות שטוח להרכבה נכונה, אחרת תאי הדמיה ידלפו. הסר בזהירות את גב הסרט כדי למנוע חבטות. מומלץ להזיז תאים מודבקים על משטח נקי כדי להחליק מגעים של תאי קלטת.
  2. הסר את החלק השני של גב הסרט כדי לחשוף את הצד הדביק של הסרט לאורך כל חריץ קאמרי. הניחו את סרט הדבק הקאמרי כלפי מעלה על משטח נקי.
  3. מערבבים שרף אפוקסי ותמיסות הקשחה ביחס 1:1 (או לפי הוראות היצרן) בסירת שקילה קטנה.
  4. השתמש בקצה P1000 כדי להניח טיפה של אפוקסי מעורב בין רצועות הסרט בקצה כל חריץ של תא הדמיה (חץ אדום; איור 1A). הניחו את סרט הדבק/צד אפוקסי על משטח נקי.
  5. יש להסיר כיסוי מצופה מאינקובטור בטמפרטורה של 70°C. יש לשטוף משטחים מצופים ולא מצופים של כיסויים עם ddH2O שש פעמים, לייבש עם גז חנקן מסונן, ולאחר מכן להצמיד לתא ההדמיה עם צד ציפוי הכיסוי לכיוון סרט הדבק.
  6. השתמש בקצה פיפטה P200 או P1000 כדי להפעיל לחץ על ממשק הזכוכית כדי להבטיח אטימה טובה בין הסרט לבין הכיסוי.
    הערה: עם אטימה נכונה, סרט דו צדדי הופך שקוף. תאי הדמיה ללא מגעים מספיקים של תאי סרט ידלפו.
  7. יש לדגור על תאים מורכבים בטמפרטורת החדר למשך 5-10 דקות לפחות כדי לאפשר לאפוקסי לאטום לחלוטין את בארות התא לפני השימוש. תוקפם של תאי זילוח פג תוך 12-18 שעות מההרכבה.
    הערה: בהתאם למיקום הסרט ואת עובי הסרט דו צדדי בשימוש, החדר התאספו יהיה נפח סופי של 20-50 μL.

4. התניה של תאי זילוח

  1. השתמש במשאבת זילוח (קצב מוגדר ל- 500 מיקרוליטר לדקה) כדי להחליף ברצף תמיסות מיזוג בתא הזילוח באופן הבא:
    1. זרימה של 50 μL של 1% BSA כדי לכוון את תא ההדמיה. הסר את החיץ העודף ממאגר התאמת Luer-lock.
    2. זרימה 50 μL של 0.005 מ"ג / מ"ל streptavidin. יש לדגור במשך 1-2 דקות בטמפרטורת החדר. הסר חיץ עודף מהמאגר.
    3. זרימה של 50 μL של 1% BSA כדי לחסום קשירה לא ספציפית. דגירה במשך 10-30 שניות. הסר חיץ עודף מהמאגר.
    4. זרימה 50 מיקרוליטר חם (37°C) 1x חיץ TIRF (1x BRB80, 50 mM KCl, 10 mM DTT, 40 mM גלוקוז, 0.25% (v/v) methylcellulose (4,000 cp)).
      הערה: אין להסיר את החיץ העודף מהמאגר. זה מונע את התא להתייבש, אשר יכול להכניס בועות אוויר לתוך המערכת.
    5. אופציונלי: זרימה של 50 μL של זרעי מיקרוטובול מיוצבים ו-50% ביוטינילטים מדוללים במאגר TIRF אחד.
      הערה: הדילול הנכון חייב להיקבע אמפירית ולהכיל שונות מאצווה לאצווה. דילול המניב 10-30 זרעים לכל שדה ראייה עובד היטב עם מערך זה.

5. הכנת מיקרוסקופ

הערה: תגובות ביוכימיות המכילות חוטי אקטין דינמיים ומיקרוטובולים מוצגות / מבוצעות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי של השתקפות פנימית (TIRF) הפוך המצויד בלייזר מצב מוצק של 120-150 mW, מטרת TIRF של טבילת שמן 63x מתוקנת טמפרטורה ומצלמת EMCCD. חלבונים בדוגמה זו מוצגים באורכי הגל הבאים: 488 ננומטר (מיקרוטובולים) ו-647 ננומטר (אקטין (אקטין - actin).

  1. הגדר את מכשיר החימום הבמתי/אובייקטיבי כך שישמור על טמפרטורה של 35-37 מעלות צלזיוס לפחות 30 דקות לפני הדמיה של התגובה הביוכימית הראשונה.
  2. הגדר את הפרמטרים של רכישת התמונה באופן הבא:
    1. הגדר מרווח זמן לרכישה לכל 5 שניות למשך 15-20 דקות.
    2. הגדר חשיפות לייזר של 488 ו- 647 ל- 50-100 אלפיות השנייה בהספק של 5%-10%. הגדר את זווית TIRF המתאימה למיקרוסקופ.
      הערה: ללא קשר להגדרת המיקרוסקופ, הדרך הפשוטה ביותר להגדיר את עוצמת הלייזר, החשיפה וזווית ה-TIRF היא לבצע התאמות בתמונות של כל אחד מהפולימרים בלבד (ראה 5.2.2.1 ו-5.2.2.2, להלן). מומלץ מאוד למשתמשים להשתמש בעוצמת הלייזר הנמוכה ביותר ובהגדרות החשיפה שעדיין מאפשרות זיהוי.
      1. התאימו את תגובת הפילמור (איור 1C) כדי להתחיל הרכבה של חוטי אקטין ולקבל תמונות ב-647 ננומטר. בצע התאמות מתאימות.
      2. התאימו את תגובת הפילמור בבאר זילוח מותנית שנייה כדי להתחיל הרכבה של מיקרוטובולים (איור 1C) ודמיינו ב-488 ננומטר. בצע התאמות מתאימות.

6. הכנת תערובות תגובה חלבוניות

  1. הכינו תמיסת מלאי של טובולין מסומן פלואורסצנטית.
    1. קבע את הריכוז של טובולין תוצרת בית ללא תווית באמצעות ספקטרופוטומטריה ב Abs280, כדלקמן:
      1. ספקטרופוטומטר ריק עם 1xBRB80 חסר GTP.
      2. חישוב ריכוז טובולין באמצעות מקדם ההכחדה שנקבע של 115,000 M‐1 cm‐1 והנוסחה הבאה:
        figure-protocol-1
    2. השהה מחדש ליזין מסחרי המסומן בליזין 488-טובולין ל-10 מיקרומטר (1 מ"ג/מ"ל; תווית 100%) עם 20 מיקרוליטר של 1x BRB80 חסר GTP.
    3. הפשיר אליקוט 7.2 מיקרוליטר של 100 מיקרומטר טובולין ממוחזר ללא תווית על קרח.
      הערה: טובולין ממוחזר הוא קריטי להרכבה מוצלחת של מיקרוטובולים במבחנה מכיוון שהוא מסיר דימרים לא כשירים לפילמור שנוצרו במאגרי חלבונים קפואים.
    4. יש לשלב 3 μL של 10 μM 488-tubulin עם aliquot 7.2 μL של 100 μM tubulin ללא תווית, לא יותר מ 15 דקות לפני השימוש.
  2. הכן את פתרון המניות של אקטין מסומן פלואורסצנטית.
    1. עבור חלבונים תוצרת בית, לקבוע את הריכוז ואת אחוז תווית של אקטין באמצעות ספקטרופוטומטריה AbsAbs290 ו Abs650, כדלקמן:
      1. ספקטרופוטומטר ריק עם G-buffer.
      2. חשב את ריכוז האקטין ללא תווית באמצעות מקדם ההכחדה שנקבע של 25,974 M‐1 cm‐1 והנוסחה הבאה:
        figure-protocol-2
      3. חשב את ריכוז הליזין המסומן Alexa-647-actin באמצעות מקדם ההכחדה של אקטין לא מסומן, מקדם תיקון פלואור של 0.03, והנוסחה הבאה:
        figure-protocol-3
      4. חשב את תווית האחוזים של Alexa-647-actin באמצעות ε שנקבעה עבור Alexa-647 של 239,000 M‐1 cm‐1, כדלקמן:
        figure-protocol-4
    2. הפשיר אחד 2 μL aliquot של 3 μM 100% מסומן ביוטין אקטין (מסומן על שאריות ליזין). לדלל פי 10 על ידי הוספת 18 μL של חיץ G.
    3. ערבבו 3 μL של אקטין מדולל ביוטינילציה, ונפחים מתאימים של אקטין לא מסומן ומסומן (לעיל), כך שהתערובת הסופית תהיה 12.5 מיקרומטר אקטין כולל עם תווית פלואורסצנטית של 10%-30%.
      הערה: יותר מ-30% מונומרים פלואורסצנטיים של אקטין (סופי) עלולים לפגוע ברזולוציית ההדמיה מכיוון שקשה להבחין בחוטים מהרקע.
  3. הכינו תערובות תגובה (איור 1C).
    1. הכינו את תערובת השלד הציטו-שלד (Tube A) על ידי שילוב של 2 μL של תערובת אקטין 12.5 מיקרומטר (6.2.3) עם תערובת מלאי טובולין (6.1.4), לא יותר מ-15 דקות לפני ההדמיה. יש לאחסן על קרח עד לשימוש.
    2. הכן תערובת תגובת חלבונים (Tube B) על ידי שילוב כל שאר רכיבי הניסוי והחלבונים, כולל 2x TIRF buffer, אנטי אקונומיקה, נוקלאוטידים, חוצצים וחלבונים נלווים. דוגמה לכך מוצגת באיור 1C.
      הערה: הדילול הסופי יוצר חיץ TIRF 1x המכיל ATP, GTP וחוזק יוני בטווח הפיזיולוגי המשוער.
  4. לדגור על צינור A וצינור B בנפרד ב 37 ° C במשך 30-60 שניות. כדי ליזום את התגובה, ערבבו והוסיפו את התוכן של צינור B לצינור A (להלן).

7. דינמיקה של אקטין ומיקרוטובול

  1. מצב זילוח היטב (איור 1B; שלב 4, לעיל).
  2. התחל הרכבה של אקטין ומיקרוטובול בו-זמנית על-ידי הוספת התוכן של צינור B (תערובת תגובה) לצינור A (תערובת שלד ציטוס) (איור 1C).
  3. זרימה של 50 μL של התגובה המכילה 1x TIRF buffer בתוספת מונומרים של 15 μM free tubulin, 1 mM GTP ו-0.5 μM actin ונפחים מתאימים של בקרות חיץ.
  4. הקלט סרטים בהילוך מהיר באמצעות תוכנת מיקרוסקופ כדי לרכוש כל 5 שניות למשך 15-20 דקות.
    הערה: התחלת דינמיקת אקטין ומיקרוטובול מתרחשת תוך 2-5 דקות (איור 2). עיכובים ארוכים יותר מצביעים על בעיות בבקרת טמפרטורה או בעיות הקשורות לריכוז של חלבונים בתמהיל התגובה.
  5. תנו באר זילוח חדשה (שלב 4) והחליפו את נפח החיץ בחלבונים מווסתים בעלי עניין (כלומר, Tau) ובפקדי חיץ (איור 1C). רכוש כמתואר בשלב 7 (לעיל) כדי להעריך חלבונים רגולטוריים עבור פונקציות אקטין-מיקרוטובול מתפתחות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

figure-results-1
איור 1. סכמות ניסיוניות: הרכבת תא זרימה לרכישת תמונה. (A) הרכבת תא הדמיה. מלמעלה למטה: תאי הדמיה של IBIDI מודבקים לאורך בארות זילוח (מסומנות בחץ); השכבה השנייה (הלבנה) של גב סרט הדבקה (שנשארה דולקת בתמונה המוצגת למשתמשים בכיוון טוב יותר) מוסרת ואפוקסי מוחל בקצה תא הזילוח (חץ). הערה: כדי לכוון את המשתמשים ביתר קלות היכן למקם את האפוקסי, הגב הלבן נשאר דולק בתמונה זו. הכיסוי הנקי והמצופה מחובר לתא ההדמיה כאשר צד הציפוי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
לא הוכרז על ניגוד עניינים.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
1% BSA (ללא רב)פישר סיינטיפיקBP1600-100למטרה זו (חסימת תאי TIRF), BSA מושעה מחדש ב- ddH20 ומסונן דרך מסנן 0.22 מיקרומטר.
1× BRB80תוצרת בית80 mM PIPES, 1 mM MgCl2, 1 mM EGTA, pH 6.8 עם KOH
80 mM PIPES, 1 mM MgCl2, 1 mM EGTA, pH 6.8 עם KOHSigma Aldrich Inc , סנט לואיס, מיזוריG2133-50KUבשילוב עם קטלאז, aliquot ולאחסן ב -80 oC עד לשימוש
100 מיקרומטר טובוליןCytoskeleton Inc, דנוור, קולורדוT240טובולינים תוצרת בית יש למחזר לפני השימוש כדי להסיר טובולין לא כשיר פילמור (Hyman et al. (1992)29; לי ומור (2020)30 ). טובולינים הזמינים מסחרית הם לעתים קרובות מדוללים מדי למחזור אך מתפקדים היטב אם הם מושהים מחדש בהתאם להוראות היצרן ומנוקים מראש באמצעות אולטרה-צנטריפוגה (278,000 × גרם) למשך 60 דקות, לפני השימוש.
100 מילימטר ATPגולד ביוטכנולוגיה בע"מ, אוליבט, מיזוריא-08מושעה מחדש ב-ddH20 (pH 7.5) ומעוקר מסנן.
100 מילימטר GTPפישר סיינטיפיקAC226250010מושעה מחדש ב-1× BRB80 (pH 6.8) ומעוקר בסינון.
לייזר מצב מוצק של 120-150 mWלייקה מיקרוסיסטמס11889151 11889148
2 מ"ג/מ"ל קטלאזSigma Aldrich Inc , סנט לואיס, מיזוריC40-100בשילוב עם גלוקוז אוקסידאז, aliquot ולאחסן ב -80 oC עד לשימוש
2× חיץ TIRFהומאד2× BRB80, 100 mM KCl, 20 mM DTT, 80 mM גלוקוז, 0.5% (v/v) methylcellulose (4,000 cp); הערה: 1 μL של 0.1M GTP ו-1 μL של 0.1M ATP נוספו בנפרד לתגובות TIRF כדי למנוע מחזורי הקפאה-הפשרה חוזרים ונשנים.
24 × 60 מ"מ, #1.5 זכוכית כיסויפישר סיינטיפיק, וולת'הם, מסצ'וסטס22-266882יש לשטוף את זכוכית הכיסוי באופן נרחב לפני השימוש (Smith et al. (2014)22 )
בלוק חום של 37 מעלות צלזיוס
אמבט מים 37 מעלות
5 מ"ג/מ"ל סטרפטווידין (600x מלאי)Avantor , פילדלפיה, PARLS000-01מושעה מחדש ב-Tris-HCl (pH 8.8); יש לדלל את ה-aliquot ל-1× במאגר HEK ביום השימוש
5 דקות שרף אפוקסי ומקשהLoctite , רוקי היל, קונטיקט1365736שילוב של שרף וקשיח עשוי להימשך עד 30 דקות לריפוי.
50% זרעי מיקרוטובולה ביוטינילציה-GpCppCytoskeleton Inc; תוצרת ביתT333P(אופציונלי) זרעי מיקרוטובולים מיוצבים GppCpp או Taxol יכולים לתווך פילמור מיקרוטובולי בצורה יעילה יותר. טקסול ו-GppCpp מייצבים מיקרוטובולים בדרכים שונות שיכולות להשפיע על מבנה סריג המיקרוטובולים ועל יכולתם של חלבוני בקרה מסוימים להיקשר לחלק המיוצב של המיקרוטובול. שיטה לייצור סוגים שונים של זרעי מיקרוטובול מתוארת ב- Hyman et al. (1992).
אינקובטור 70 C
מלאי תמהיל אקטיןתוצרת בית; פרוטוקול זהתערובת אקטין של 12.5 מיקרומטר המורכבת מאקטין מסומן (פלואורסצנטי וביוטינילציה) ואקטין לא מסומן עבור עד שש תגובות. 2 μL של מלאי משמש בתגובת TIRF הסופית. הריכוז הסופי של אקטין המשמש בכל תגובה הוא 0.5 מיקרומטר (10% Alexa-647; 0.09% מסומן ביוטין).
פקדי מאגר מתאימיםתוצרת ביתשילוב של חוצצים מכל החלבונים המוערכים
ביוטין-PEG-סילאן (MW 3,400)Laysan ביו Incביוטין-PEG-SIL-3400ניתן ל-2-5 מ"ג aliquots, ממולא בחזרה בחנקן, פרפילם סגור, ומאוחסן ב -20 C עם חומר מייבש עד לשימוש
אקטין ביוטינילציהCytoskeleton Inc; תוצרת ביתAB07ביוטין-אקטין מיוצר על-ידי סימון על שאריות ליזין ולכן מניחים שהוא מסומן לפחות ב-100%, אבל משתנה עם כמויות גדולות / תכשירים שונים. ריכוזי אקטין אופטימליים של ביוטינילציה חייבים להיקבע אמפירית לשימושים מסוימים/תכנונים ניסיוניים. ריכוזים גבוהים יותר מאפשרים מעקב יעיל יותר, אך עלולים לעכב פילמור או אינטראקציות עם חלבונים רגולטוריים. כאן, אחוז קטן (0.09% או 900 pM) אקטין biotinylated נוכח בתגובת TIRF הסופית.
סבון כליםשחר, פרוקטר אנד גמבל, סינסינטי, אוהיומסיבות לא ידועות, הגרסה הכחולה מנקה את החלקות הכיסוי ביעילות רבה יותר מאשר צבעים זמינים אחרים.
קרח יבש
אקטין מסומן באופן פלואורסצנטיCytoskeleton Inc; תוצרת ביתAR05אקטין תוצרת בית המסומן באופן פלואורסצנטי מאוחסן במאגר G בתוספת 50% גליצרול ב -20 C (Spudich et al. (1971) 47; Liu et al. (2022)48 ). אקטין עם תווית פלואורסצנטית מחויג כנגד חיץ G ומנוקה מראש באמצעות אולטרה-צנטריפוגה למשך 60 דקות במהירות של 278,000 × גרם לפני השימוש.
טובולין מסומן באופן פלואורסצנטיCytoskeleton IncTL488M, TLA590M, TL670Mמשהה מחדש ב-20 μL 1× BRB80 (ריכוז סופי של 10 מיקרומטר) ומנוקה מראש באמצעות אולטרה-צנטריפוגה (278,000 × גרם) למשך 60 דקות, לפני השימוש.
חיץ Gתוצרת בית3 mM Tris-HCl (pH 8.0), 0.2 mM CaCl2, 0.5 mM DTT, 0.2 mM ATP
HEK Bufferתוצרת בית20 mM HEPES (pH 7.5), 1 mM EDTA (pH 8.0), 50 mM KCl
קרח
דלי קרח
תא הדמיהIBIDI , פיצ'בורג, ויסקונסין80666הזמינו תאים ללא תחתית לשימוש בציפויי כיסוי שונים
מצלמת EMCCD iXon Life 897אנדור, בלפסט, צפון אירלנד8114137
תוכנת מיקרוסקופ LASX Premiumלייקה מיקרוסיסטמס8114137
מתילצלולוז (4,000 cp)סיגמא אולדריץ' בע"מM0512
בסיס מיקרוסקופ מצויד במודול TIRFLeica Microsystems, Wetzlar, גרמניה11889146
mPEG-silane (MW 2,000)
צלזיוס

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Time lapse

מאמרים קשורים