$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. ביצוע LLSM יישור יומי
הערה: (חשוב) פרוטוקול יישור זה מבוסס על מכשיר LLSM המשמש (ראה טבלת חומרים). כל LLSM עשוי להיות שונה ולדרוש אסטרטגיות יישור שונות, במיוחד אלה שנבנו בבית. בצע את היישור השגרתי המתאים והמשך לסעיף 2.
- הוסף 10 מ"ל מים בתוספת 30 μL פלואורסצאין (1 מ"ג / מ"ל מלאי) לאמבט LLSM (~ 10 מ"ל נפח), לחץ על תמונה (בית) כדי להזיז את המטרה למיקום התמונה והתבונן בתבנית קרן לייזר בסל יחידה. יישרו את קרן הלייזר באמצעות קווי עזר ואזור עניין מוגדר מראש (ROI) כדי להפוך את הקרן לתבנית דקה המאוזנת לכל הכיוונים.
- הקרן צריכה להיראות ממוקדת גם במצלמת המוצא. השתמש בשני מתאמי הטיית מראה, מיקרומטר עליון, מיקוד וצווארון יעד פליטה כדי לכוונן. ראו איור 1, A ו-B עבור הקרן המיושרת כהלכה.
- לשטוף את האמבטיה ואת המטרות עם לפחות 200 מ"ל של מים כדי להסיר לחלוטין פלואורסצאין.
- תמונה חרוזים פלואורסצנטיים סטנדרטיים במדיית ההדמיה (שהוכנו על ידי הדבקת חרוזים לכיסוי 5 מ"מ עם פולי-L-ליזין, ראה טבלת החומרים; ניתן להכין זאת מראש ולעשות בה שימוש חוזר) עבור פונקציית פיזור נקודה פיזית (PSF) במדיית הדמיה.
הערה: יכול להיות רק חרוז אחד לעיבוד מאוחר יותר, לכן נסה למצוא חרוז בפני עצמו בצופה או שניתן לחתוך אותו בקלות כדי לקבל חרוז יחיד.
- הפעל את dither על-ידי הגדרתו ל- 3 בתיבה 'טווח X Galvo'. לחץ על Live כדי להציג את השדה הנוכחי. נועו בכיוון Z כדי למצוא את הכיסוי והחרוזים. מצא את מרכז החרוז על-ידי תנועה לאורך Z, לחץ על עצור כדי להשהות את הלייזר. סמן את תלת-ממד, הקש מרכז ולאחר מכן הקש על ביצוע. פעולה זו תאסוף את הנתונים.
- כוונן ידנית את מראה ההטיה, צווארון המטרה ומיקרומטר המיקוד לקבלת הערכים האפורים הגבוהים ביותר, ולאחר מכן התאם לפי הצורך כדי להשיג תבניות מתאימות למצבי לכידת סריקה אובייקטיבית, z galvo, z+objective (totPSF) וסריקת דגימה (samplePSF). ראה איור 1 C-F לקבלת הקרנות בעוצמה מרבית (MIPs) מותאמות כראוי.
הערה: מצבי הלכידה השונים (סריקה אובייקטיבית, z galvo, z+objective וסריקת דגימה) משנים את האופן שבו גיליון האור נע בדגימה. יש להשתמש בכל מצבי הסריקה לצורך יישור.
- סריקת הדגימה מראה כיצד ייאספו נתונים במהלך הניסוי. אסוף את PSF לדוגמה על-ידי הקשה על Execute במצב סריקה לדוגמה עבור Deskewing ו- Deconvolution. שנה מדפסות לייזר לשלושה מצבי צבע (488, 560, 647) והקש שוב על Execute.
הערה: מכיוון שתמונות LLSM נמצאות בזווית (57.2°), תמונות שצולמו במצב "סריקת דגימה" נאספות בזווית זו, ולכן הן "מוטות". ביטול הטייה הוא תהליך של תיקון זווית זו ו"יישור מחדש" של התמונה לערימת z אמיתית. נתונים אלה חייבים להיאסף באמצעי הדמיה ובכל הערוצים שיצולמו במהלך הניסוי. אם זה לא נאסף כראוי, הנתונים לא יהיו מוטים כראוי. באופן דומה, ודא שהמדיה חוממה ל -37 מעלות צלזיוס (או טמפרטורת הניסוי הרצויה).
2. הגדרת תאים באמצעות LLSM
- הוסיפו 100,000 תאים מציגי אנטיגן (APC) (50 μL) למכסה עגול בקוטר 5 מ"מ ואפשרו להם להסתפק במשך 10 דקות.
- משמנים את מחזיק הדגימה ולאחר מכן מוסיפים לו את תא הכיסוי. הוסיפו טיפה של אמצעי הדמיה לחלק האחורי של הכיסוי כדי למנוע בועות לפני שתניחו אותו באמבטיה. הברג את מחזיק הדגימה לפיזו ולחץ על Image (Home).
- מצא APC לתמונה כדי להבטיח כי LLSM ותוכנת הדמיה (ראה טבלה של חומרים) פועלים כראוי.
הערה: אנו מצילמים בגודל צעד של 0.4 מיקרומטר עם 60 צעדי z וחשיפה של 10 אלפיות השנייה לשני צבעים עם מיזוג אוויר מוגדר ל- 3, מה שמביא ל- 1.54 שניות לכל מסגרת של התמונה התלת-ממדית עם ~ 200 ננומטר XY ורזולוציית Z של 400 ננומטר. ייתכן שיהיה צורך להתאים הגדרות אלה בהתבסס על גודל התא, רזולוציית z הרצויה ועוצמת האות מטכניקת הסימון הפלואורסצנטית שבה נעשה שימוש. צריכת החשמל בלייזר תשתנה גם בהתאם לטכניקת הסימון הפלואורסצנטי בה נעשה שימוש.
- לחצו על 'שידור חי' כדי להציג את התמונה הנוכחית. עבור לאורך Z כדי למצוא את הכיסוי ואת התאים.
- מצא את מרכז הנגמ"ש על-ידי תנועה בכיוון Z ולאחר מכן לחץ על עצור כדי להשהות את הלייזר. בדוק תלת-ממד והזן את ההגדרות הרצויות, לחץ על מרכז ולאחר מכן לחץ על ביצוע. פעולה זו תאסוף את הנתונים.
- הנמיכו את הבמה למיקום ההעמסה והוסיפו 50 μL של תאי T במדיית הדמיה (100,000 תאים) ישירות מעל הכיסוי. עדיף לתת טיפה טופס על קצה פיפטה קצה ולאחר מכן לגעת בקצה נוזל האמבטיה. הרם את הבמה בחזרה על ידי לחיצה על "תמונה (החזרה)".
- התחל בהדמיה. הקפד להגדיר את גודל הערימה הרצוי ואת אורך קיטועי הזמן. לדוגמה, תמונה בערימות z של 60 בגודל צעד של 0.4 מיקרומטר והזנת מסגרות של 500 פעמים. (בדרך כלל) הפסק את ההקלטה לפני שמגיעים ל- 500 פריימים כדי למנוע הלבנה. השתמש במצב חי כדי לחפש זוגות תאים, וכאשר ההגדרות הוזנו מוכנות ורצויות, הקש Execute כדי לאסוף נתונים. ראו איור 2 לדוגמה.
