מאמר שיטה

מיקרוסקופ Darkfield להמחשת דינמיקה דיפוזית של ננו-מוטות על קרום התא

8 ביולי 2025

במאמר זה

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מקור: Ge, F., et al. Visualizing Diffusional Dynamics of Gold Nanorods on Cell Membrane using Single Nanoparticle Darkfield Microscopy. J. Vis. Exp. (2021).

בסרטון זה, אנו מתארים את טכניקת מיקרוסקופ השדה האפל (DFM) בשילוב עם ניתוח מעקב אחר חלקיקים בודדים (SPT) כדי לנטר את האינטראקציה של ננו-מוטות זהב פלסמוניים עם קרום התא של קו עניין ספציפי. ניתוח משולב של DFM ו-SPT מאפשר הדמיה של תנועת הננו-מוט דרך קרום התא ברזולוציה מרחבית-זמנית גבוהה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. הכנת שקופיות במיקרוסקופ

הערה: תאי U87 MG מהדור השלישי עד העשירי עם פעילות גבוהה משמשים בניסויי SPT.

  1. יש לעקר 22 מ"מ × כיסויים בקוטר 22 מ"מ שכבר נוקו בתמיסת פיראנה על ידי טבילה באתנול (99.9%).
  2. השתמשו במלקחיים כדי להוציא את חלקת הכיסוי מתמיסת האתנול (שלב 1.1) ולעקר על ידי שריפת אתנול על הלהבה. לאחר שכל האתנול נשרף, הניחו את הכיסויים בכלי תרבית תאי פלסטיק (35X10 מ"מ) מלא ב-2 מ"ל של תווך תאים (ללא פנול אדום).
  3. הוסף 50 μL של תרחיף התא על הכיסוי ולדחוף בעדינות את הצלחת קדימה ואחורה ושמאלה וימינה כדי לפזר את התאים באופן שווה. מקמו אותו באווירה לחה.
  4. כאשר תאי U87 MG על הכיסוי מגיעים למפגש של 20%-40% (~12 שעות), יש להוסיף 20 μL של CTAB-AuNRs (ננו-מוטות זהב המסונתזים עם מולקולת אמוניום ברומיד cetyltrimethylammonium כחומר מגן,138 pM) לצלחת ולהתפזר. דוגרים באווירה לחה במשך 5 דקות.
  5. הוסיפו 100 מיקרוליטר של מדיום התרבית (ללא פנול אדום) מהמנה בשלב 1.4 לחריץ של מגלשת הזכוכית המחורצת (איור 1) אשר מנוקה מראש עם תמיסת פיראנה.
  6. הוציאו את הכיסוי מהצלחת והפכו אותו בחלק העליון של החריץ של שקופית זכוכית המיקרוסקופ (איור 1). אטמו אותו בלק, הניחו לו להתייבש והניחו אותו על הבמה לביצוע ניסויי SPT.

2. ביצוע ניסויי מעקב אחר חלקיקים בודדים במיקרוסקופ שדה אפל (איור 1).

  1. מניחים טיפת שמן על מעבה השדה הכהה השקוע בשמן (צמצם מספרי (NA) 1.43-1.20) וסובבו את הידית כדי לגרום למעבה ליצור מגע עם הזכוכית להחליק.
  2. הניחו טיפת שמן על החלק העליון של זכוכית הכיסוי וסובבו את ידית המיקוד כדי לגרום ליעד טבילת השמן פי 60 (NA 0.7–1.25) לגעת בשמן.
  3. הפעל את מקור האור וסובב מעט את ידית המיקוד כדי למקד את מישור ההדמיה.
    הערה: בשדה הראייה, הרקע שחור, התאים בהירים, וה-CTAB-AuNRs (יחס גובה-רוחב ~2:1, איור 2) הם כתמי פיזור קטנים (אדום, צהוב או ירוק).
  4. לכוד אור פיזור דגימה באמצעות מצלמת CMOS צבעונית. לחץ על "מצלמה סמל" בתוכנה כדי להקליט ולייצא פורמט TIFF לשמירת תמונות.

3. רכישת נתונים

  1. חלץ מסלול יחיד לטווח ארוך
    1. פעלו כמתואר באיור 3 כדי להמיר את תמונות השדה הכהה ממצב "צבע RGB" למצב "8 סיביות". בתמונה J לחץ על תמונה | סוג | 8 סיביות. כדי להתאים את הניגודיות, לחץ על תמונה | התאמה | בהירות | ניגודיות.
    2. בחר חלקיק יעד וחתוך את הרקעים של סדרות הזמן על ידי אגרוף ומחיקת הרקע עם "Ctrl+X".
    3. פתח את החלון זיהוי חלקיקים וקישור חלקיקים על ידי לחיצה על "תוספים | Particle Tracker Classic | גשש חלקיקים".
    4. הגדר את הרדיוס ל- 6, את הסף ל- 0 ואת האחוזון ל- 0.01%.
      הערה: כדי לזהות את החלקיק, התאם את שלושת הפרמטרים לעיל בעזרת תצוגה מקדימה. ודא שהרדיוס גדול מעט מחלקיק היעד וקטן יותר מההפרדה הקטנה ביותר בין חלקיקים. אחוזון הוא הגבול התחתון של התפלגות העוצמה שהם חלקיקים מועמדים.
    5. הגדר את טווח הקישור ל- 5 ואת ההזחה ל- 10.
      הערה: לקישור החלקיק בין מסגרות סמוכות רצופות, התאימו את שני הפרמטרים לעיל. הזחה היא מספר הפיקסלים המרבי שחלקיק יכול להזיז בין שתי מסגרות עוקבות, ו'טווח קישורים' הוא מספר המסגרות העוקבות שיש לקחת בחשבון בשעת קביעת ההתאמה המתאימה הטובה ביותר.
    6. לחץ על "אישור" כדי לפתוח את החלון ParticleTracker Results כדי לראות את התוצאות.
    7. לחץ על "הצג באופן חזותי את כל המסלולים" כדי לבדוק את המסלולים שנוצרו.
    8. לחץ על התפריט "Relink Particles" בחלק העליון כדי לקשר מחדש את החלקיקים שזוהו עם טווחי קישורים שונים ופרמטרים אחוזונים שונים, אם המסלול שנוצר על ידי תוכנה אינו תואם את המסלול הנע של AuNR.
    9. לחץ על "שמור דוח מלא" כדי לשמור תוצאות אם המסלול שנוצר על-ידי תוכנה והמסלול הנע של AuNR תואמים.
      הערה: דוגמה לחילוץ מסלול ארוך טווח יחיד עם תמונה J מוצגת באיור 4.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

figure-results-1
איור 1: דיאגרמה סכמטית של הנתיב האופטי של מיקרוסקופ שדה אפל, הכנת שקופיות במיקרוסקופ ושיטת הפרש הערוצים הדו-ערוצי לחישוב זווית קוטבית (θ) של AuNRs. סרגל קנה המידה בתמונה הוא 2 מיקרומטר.

figure-results-2
איור 2: אפיון CTAB-AuNRs. (A) תמונות TEM של CTAB@AuNRs. (B) ספקטרום LSPR של CTAB@AuNRs. (C...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
לא הוכרז על ניגוד עניינים.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
ננו-מוטות זהב מצופים CTAB (CTAB-AuNRs)ננוזדזNR-40-65085 ננומטר*40 ננומטר
מצלמת CMOS צבעוניתאולימפוסDP74יפן
כיסוייםסיטוגלאסz10212222C22*22 מ"מ
מיקרוסקופ שדה כההניקון80ימיקרוסקופ זקוף
סרום בקר עוברי (FBS)גיבקו10099141
פיג׳יהמכונים הלאומיים לבריאות2.0.0-rc-69/1.52 pהפצה של ImageJ
מגלשת זכוכית מחורצתמותג מפרש7103חדר קעור ליחיד
תמונה Jתמונה J1.52 J
MATLABמת'וורקסR2019b
קוד MATLABhttps://github.com/fenggeqd/ JOVE-2020
כלים לתרבית תאי פלסטיקבז353002
כלים לתרבית תאי פלסטיקבז35300135*10 מ"מ
תא U87 MGאוסף תרבות הטיפוס האמריקאיATCC HTB-14קו תאי גליובלסטומה ראשוני אנושי
מדיום חיוני מינימלי (MEM) גיבקו 51200038ללא פנול אדום
פניצילין-סטרפטומיצין גיבקו 15140122

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

מאמרים קשורים