$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. שינוי מיקרוסקופ ועדשה אובייקטיבית
- הכניסו מראה 50/50 לגלגל הסינון של המיקרוסקופ הפלואורסצנטי באמצעות קוביית מסנן מתאימה (איור 1). טפל במראה 50/50 בזהירות מכיוון שלעתים קרובות יש להם ציפוי נגד השתקפות.
הערה: השתמשנו במראה 50/50 בקוביית פילטר ריקה של המיקרוסקופ. מראה 50/50 מוכנסת במקום בו ממוקמת המראה הדיכרואית.
- יש להשתמש במטרת שמן להגדלה גבוהה/צמצם מספרי גבוה (NA).
הערה: בפרוטוקול זה, השתמשנו במטרה של 100x/1.3 NA.
2. הכנת התא להדבקת מיקרוטובולים על פני השטח
- מגלשות מיקרוסקופ נקיות וכיסויים בגודל 22 מ"מ x 22 מ"מ (למיקרוסקופ זקוף) או כיסויים בגודל 22 מ"מ x 22 מ"מ וכיסויים בגודל 18 מ"מ x 18 מ"מ (למיקרוסקופים הפוכים). שנה את פני השטח לפי הצורך. לדוגמה, נקו את הכיסויים באמצעות חומר ניקוי אלקליין (ראו טבלת חומרים) ואחריו 100% אתנול עם שטיפות מים מזוקקות בין לבין ואחרי.
- חתכו רצועות ברוחב 3 מ"מ של סרט פרפין מפלסטיק (ראו טבלת חומרים) באמצעות סכין גילוח ושקופית מיקרוסקופ נוספת כקצה.
- הניחו שתי רצועות פלסטיק של סרט פרפין במרחק של 3 מ"מ זו מזו על מכסה נקי בגודל 22 x 22 מ"מ. לאחר מכן הניחו מכסה בגודל 18 מ"מ x 18 מ"מ ליצירת ערוץ. אם אתם משתמשים במיקרוסקופ זקוף, הניחו את הרצועות על גבי מגלשת מיקרוסקופ נקי ולאחר מכן הניחו על גבי כיסוי.
- הניחו את הכיסוי (או החלקה) על בלוק חום בטמפרטורה של 100°C למשך 10-30 שניות כדי שסרט הפרפין ייצור תעלה אטומה.
- זרימה של 50 מיקרוגרם/מ"ל נוגדנים (ב-Brinkley Buffer 1980 (BRB80)) על ידי זילוח באמצעות פיפטה. יש לדגור במשך 10 דקות< בר/>
הערה: אנו משתמשים בנוגדנים נגד רודמין כדי לקשור זרעי מיקרוטובולים המסומנים ברודמין לפני השטח. לחלופין, ניתן להשתמש באבידין כדי לקשור זרעי מיקרוטובולים המסומנים בביוטין או לחלקיקי זהב ביוטינילציה. כדי פשוט להסתכל על microtubules בהיעדר tubulin בתמיסה (כלומר, בדיקה לא דינמית), נוגדן אנטי tubulin ניתן להשתמש.
- יש לכבס חמש פעמים עם חיץ BRB80. מומלץ לסנן את התמיסות באמצעות מסנן 0.22 מיקרומטר.
- זרימה ב-1% poloxamer 407 (קופולימר טריבלוק) ב-BRB80 כדי לחסום את פני השטח כנגד הקשירה הלא ספציפית. דוגרים במשך 10 דקות.
- יש לכבס חמש פעמים עם חיץ BRB80.
- הדגימה מוכנה להצבה על המיקרוסקופ. כדי למנוע מהדגימה להתייבש, הוסיפו שתי טיפות של חיץ BRB80 בקצות התעלה וחדשו בעת הצורך.
3. יישור מיקרוסקופ
- הניחו את הדגימה על במת המיקרוסקופ. הפעל את מקור האור epi-illumination.
- התמקדו במשטח הדגימה. תוכלו לצפות במשטחים מרובים כאשר המטרה נעה למעלה ולמטה עקב ההשתקפות האחורית של האור מהאופטיקה בתוך הנתיב האופטי. שיטה טובה למצוא את משטח הדגימה היא להתמקד בקצה סרט הפרפין. לאחר מציאת המשטח, הגדר את שדה הראייה למרכז החדר.
- מרכז את דיאפרגמת השדה בשדה הראייה על ידי סגירתו באמצע הדרך ושימוש בברגי הכוונון. לאחר היישור, פתח מחדש את הסרעפת.
הערה: התאמת בורג צריכה להיעשות רק באופן ספורדי, אולי כל 3-6 חודשים או בעת פתרון בעיות.
- החלק בעדשת ברטרנד כדי להציג את אישון היציאה (מישור המוקד האחורי) של המטרה.
- סגור את דיאפרגמת הצמצם (AD) מעבר לקצוות אישון היציאה של המטרה.
- השתמש בברגי הכוונון כדי למרכז את ה- AD עם אישון היציאה. בדוק שוב על ידי פתיחת AD והתאמת הקצוות שלה לאלה של אישון היציאה.
הערה: התאמה זו צריכה להיעשות רק באופן ספורדי.
- הגדר את דיאפרגמת הצמצם לכ- 2/3 מה- NA של המטרה.
4. הדמיה מיקרוטובולים מיוצבים או חלקיק זהב 40 ננומטר
הערה: מיקרוטובולים מיוצבים וננו-חלקיקי זהב משמשים כדגימות בקרה טובות. מומלץ לצלם מיקרוטובולים המחוברים לפני השטח או ננו-חלקיקי זהב כצעד ראשון להערכת ביצועי IRM ולסייע בקביעת פתח הסרעפת האופטימלי (סעיף 7).
- הגדר את זמן החשיפה של המצלמה ל- 10ms וכוונן את התאורה כך שתרווי כמעט את הטווח הדינמי של המצלמה.
- זרימה ב-10 מיקרו-ליטר של מיקרוטובולים מיוצבים בגואניל-(אלפא, בטא)-מתילן-דיפוספונט (GMPCCP) או טקסול-מיוצבים ב-BRB80 (או חלקיקי זהב 40 ננומטר) על ידי זילוח באמצעות פיפטה לדגימה טרייה וקשירת ניטור על ידי הדמיה של פני השטח. לאחר ש-10-20 מיקרוטובולים קשורים בתוך שדה הראייה, שטפו את הדגימה פי 2 עם BRB80.
הערה: עם מיקרוסקופ מיושר היטב, המיקרוטובולים צריכים להיות גלויים ללא חיסור רקע.
- קבל 10 תמונות על-ידי הגדרת קיטועי זמן עם תקופת השהיה של שנייה אחת למשך 10 שניות (בחשיפה של 10 אלפיות השנייה).
- קבל תמונת רקע. לשם כך, הזז את הבמה באמצעות בקר הבמה או תוכנת המחשב לאורך הציר הארוך של הערוץ תוך קבלת 100 תמונות ללא עיכוב (כלומר, הזרמה קרוב ל- 100 fps @ 10 ms exposure).
הערה: הרקע הוא החציון של 100 התמונות. על ידי לקיחת החציון, פרופיל התאורה ותכונות נייחות אחרות כמו לכלוך על האופטיקה נשמרים בזמן שכל השאר מסונן החוצה. לא צריכה להיות הטיה על הדגימה מכיוון שהדבר יוביל לשינוי במיקום הציר כאשר הבמה מוזזת ובסופו של דבר יפגע בתמונת הרקע. אם לא ניתן להימנע מההטיה, שיטה חלופית היא לרכוש תמונות רקע ממוצעות לפני הזרמת הזרעים.
- לעיבוד וניתוח התמונות, עבור לשלב 6.
5. דינמיקה של מיקרוטובולים
- לדינמיקה של מיקרוטובולים באמצעות טובולין במוח, כוונו את טמפרטורת מחמם הדגימה ל-37°C.
- זרימה פנימה 10 μL של זרעי מיקרוטובולים מיוצבים GMPCCP ב-BRB80 על ידי זילוח באמצעות פיפטה לדגימה טרייה וניטור קשירתם לפני השטח על ידי הדמיה של פני השטח בשידור חי (כלומר, בזמן הזרמה). ברגע ש-10-20 זרעים קשורים לשדה הראייה, שטפו את הדגימה בנפח 2x ערוצים עם BRB80 (BRB80 צריך להיות מחומם מראש ל-37°C או לפחות בטמפרטורת החדר).
הערה: עם מיקרוסקופ מיושר היטב, הזרעים צריכים להיות גלויים ללא חיסור רקע.
- זרימה בתערובת פילמור (7.5 מיקרומטר טובולין ללא תווית + 1 מ"מ גואנוזין טריפוספט (GTP) + 1 מ"מ Dithiothreitol (DTT) במאגר BRB80). למדידת צמיחת מיקרוטובול, הגדר קיטועי זמן באמצעות תוכנת הרכישה כדי לקבל תמונה כל 5 שניות (0.2 פריימים לשנייה (fps)) למשך 15 דקות.
- כדי לשפר את הניגודיות, רכוש 10 תמונות (במקום אחת) בכל נקודת זמן וממוצע אותן. להתכווצות מיקרוטובול, קבל תמונות בקצב של 100 fps על-ידי הגדרת השהיית הזמן ל- 0 וזמן חשיפה של 10ms (fps גבוה יותר אפשרי עם אזורי עניין קטנים יותר בהתאם למצלמה שבה נעשה שימוש).
- קבל תמונת רקע כמו בשלב 4.4.
6. עיבוד וניתוח תמונה
הערה: לצורך ניתוח, פרוטוקול זה משתמש בפיג'י, אך הקורא חופשי להשתמש בכל תוכנה שהוא / הוא מוצא מתאים.
- פתח תמונות רקע שמורות.
- חשב את התמונה החציונית (כלומר, רקע) באמצעות פרויקט Image > Stack > Z > החציון.
- פתח את הסרט Microtubule Dynamics כערימה (זהה עבור מיקרוטובולים שאינם דינמיים) באמצעות File > Open.
- החסר את תמונת הרקע מהערימה באמצעות מחשבון Process > Image. הקפד לבדוק את האפשרות "תוצאה של 32 סיביות (ציפה)".
- עבור מיקרוטובולים דינמיים, באמצעות כלי הקו צייר קו לאורך המיקרוטובול של עניין והוסף אותו לאזור של מנהל עניין על ידי לחיצה על "t". חזור על הפעולה עבור כל microtubules של עניין.
- עבור מיקרוטובולים דינמיים, הפעל את המאקרו Multi-Kymo. המאקרו יפיק וידאו וקימוגרף לכל מיקרוטובול במנהל החזר ההשקעה. כל מיקרוטובול יקבל מזהה ייחודי.
- עבור מיקרוטובולים דינמיים, הפעל את המאקרו Kymo-Analysis ופעל לפי צעדיו כדי למדוד את שיעורי הצמיחה ושיעורי ההתכווצות של המיקרוטובולים.
7. גודל דיאפרגמת צמצם
הערה: גורם חשוב לרכישת תמונות בניגודיות גבוהה של מיקרוטובולים באמצעות IRM הוא הגדרת הצמצם המספרי של ההארה (INA) בצורה נכונה. ניתן לשנות את ה-INA על-ידי שינוי גודל קרן ההארה הנכנסת באישון היציאה של המטרה, אשר נשלטת על-ידי גודל ה-AD (ה-AD ממוקם במישור מצומד עם אישון היציאה (מישור המוקד האחורי) של המטרה, איור 1):
כאשר DAD הוא קוטר הסרעפת של הצמצם, fobjective הוא אורך המוקד של המטרה ו-Dep הוא קוטר אישון היציאה של המטרה. בדרך כלל, האלצהיימר נשאר פתוח לחלוטין להדמיית פלואורסצנטיות, כך שה-INA שווה ל-NA של המטרה. במיקרוסקופ פלואורסצנטי, סולם האלצהיימר אינו מציין את קוטרו, ולכן לא ניתן לחשב את ה-INA. ניתן לכייל את גודל האלצהיימר בעזרת מטרה. עם זאת, זה לא הכרחי מכיוון שגודל AD יהיה קבוע לגודל שמייצר את הניגודיות הגבוהה ביותר.
- הכינו דגימה של מיקרוטובולים מיוצבים המסומנים באופן פלואורסצנטי דבוקים לפני השטח (שלבים 4.1-4.2).
הערה: השתמשנו בטטרמתילרודאמין שכותרתו מיקרוטובולים (לדוגמה: 550 ננומטר, Em: 580 ננומטר).
- הביאו מיקרוטובולים למיקוד באמצעות ידית מיקוד המיקרוסקופ תוך הדמיה פלואורסצנטית שלהם (אם מיקרוטובולים אינם מסומנים, דמיינו אותם עם IRM או DIC).
- הגדר את חשיפת המצלמה ל- 10 אלפיות השנייה באמצעות תוכנת המצלמה.
הערה: חשיפה זו שרירותית וגם חשיפה של 100 מילישניות תעבוד.
- סגרו את הספירה עד לפתח הקטן ביותר שלה. כוונן את התאורה כדי להרוות כמעט את הטווח הדינמי של המצלמה או למקסימום האפשרי.
הערה: כמדריך, השתמש בטבלת בדיקת המידע המסופקת בדרך כלל על-ידי תוכנת הרכישה.
- רכוש 10 תמונות (על ידי הזרמה או צילום תמונה בכל שנייה) של שדה ראייה המכיל 10+ microtubules.
- קבל תמונת רקע כמו בשלב 4.4.
- שנה את גודל האלצהיימר וחזור על שלבים 7.5-7.6 עבור כל טווח הפתיחה של AD (מגודל האישון הסגור ועד גודל האישון היוצא, איור 2). בכל פעם שגודל AD משתנה, התאם את עוצמת התאורה כך שתתאים לזו של שלב 7.4.
- עבור כל שדה ראייה שנרכש, החסר את הרקע המתאים באמצעות מחשבון תמונה > תהליך ובחירה "חיסור" מהתפריט הנפתח. ודא שהאפשרות "תוצאה של 32 סיביות (ציפה)" מסומנת. לאחר מכן בצע ממוצע של התמונות המתקבלות באמצעות תמונה > ערימה > פרוייקט Z> בממוצע.
- מדדו את יחס רעשי האות לרקע (SBR) של המיקרוטובולים המוגדרים כעוצמה הממוצעת של אות המיקרוטובולים (עוצמת המיקרוטובול פחות עוצמת הרקע) חלקי סטיית התקן של הרקע (איור 3).
- קבע את גודל האלצהיימר האופטימלי (כלומר INA אופטימלי) על-ידי חישוב ה-SBR הממוצע של המיקרוטובולים עבור כל גודל פתיחה, והגדר את גודל האלצהיימר לזה שמפיק את ה-SBR הגבוה ביותר (איור 2). ייתכן שיש טווח של גדלי AD המייצרים ניגודיות דומה.
