מיקרוסקופ השתקפות הפרעות להדמיה ללא תוויות של דינמיקה של מיקרוטובולים

Abstract

מקור: Mahamdeh, M., et al. יישום מיקרוסקופ השתקפות הפרעות להדמיה מהירה ונטולת תוויות של מיקרוטובולים. J. Vis. Exp. (2019).

בסרטון זה, אנו מתארים את טכניקת מיקרוסקופ השתקפות ההפרעות (IRM) כדי לדמיין מיקרוטובולים הגדלים על משטח כיסוי בנוכחות חיץ מתאים. עם הארה עם תאורת אירוע, ממשק חיץ הכיסוי וממשק החיץ-מיקרוטובול מחזירים אור, המשתלב ליצירת תבנית התאבכות, ומאפשר הדמיה של מיקרוטובולים כתמונות בעלות ניגודיות גבוהה על רקע בהיר.

Protocol

1. שינוי מיקרוסקופ ועדשה אובייקטיבית

1. הכניסו מראה 50/50 לגלגל הסינון של המיקרוסקופ הפלואורסצנטי באמצעות קוביית מסנן מתאימה (איור 1). טפל במראה 50/50 בזהירות מכיוון שלעתים קרובות יש להם ציפוי נגד השתקפות.
   הערה: השתמשנו במראה 50/50 בקוביית פילטר ריקה של המיקרוסקופ. מראה 50/50 מוכנסת במקום בו ממוקמת המראה הדיכרואית.
2. יש להשתמש במטרת שמן להגדלה גבוהה/צמצם מספרי גבוה (NA).
   הערה: בפרוטוקול זה, השתמשנו במטרה של 100x/1.3 NA.

2. הכנת התא להדבקת מיקרוטובולים על פני השטח

1. מגלשות מיקרוסקופ נקיות וכיסויים בגודל 22 מ"מ x 22....

Results

איור 1. ייצוג סכמטי של IRM. (A) אפי-הארה ממקור האור עוברת דרך הסרעפת של הצמצם לפני שהיא מגיעה למראה 50/50. דיאפרגמת הצמצם קובעת את רוחב הקרן ובכך את ההארה NA. מראה 50/50 משקפת חלקית את האור עד למטרה להאיר את הדגימה. האור המוחזר מהדגימה נאסף ולאחר מכן מוקרן על שבב המצלמה (על ידי עדשת הצינור), שם הוא מפריע ליצירת התמונה. ניגודיות התמונה היא תוצאה של התאבכות בין האור המוחזר מממשק זכוכית/מים (I1) לבין האור המוחזר מממשק המים/מיקרוטובולים.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
מיקרוסקופ	ניקון	טי-אקליפס	מיקרוסקופ הפוך המשמש לניקוב האקספרימנטים
מפצל קרן 50/50	כרומה	21000	בעת הקנייה הקפידו לבחור את מידות המפצל המתאימות לקובייה בה נעשה שימוש במיקרוסקופ
תוכנית NIKON FLUOR 100X/0.5-1.3 המטרה Iris	ניקון	MRH02902	מטרת הדמיה. למטרה זו יש קשתית מכווננת NA שנפתחה ל-NA 1.3
חומר ניקוי אוניברסלי מוקסול	סיגמא-אולדריץ'	Z637181-2 ליטר	משמש לניקוי כיסויים ומגלשות
סרט פרפין מפלסטיק (שם מסחרי Parafilm M)	סיגמא-אולדריץ'	P7793	משמש לבניית ערוצי זרימה
נוגדנים נגד TAMRA	Invitrogen	A-6397	משמש לקשירת מולקולות המסומנות ב-TAMRA (למשל מיקרוטובולים) למשטח הדגימה. $$ (AB_2536196)
Poloxamer 407 (שם מסחרי Pluronic F-127)	סיגמא-אולדריץ'		משמש לחסימת משטח הערוץ למניעת קשירה לא ספציפית
ננו-חלקיקי זהב 40 ננומטר	סיגמא-אולדריץ'	753637	משמש כדוגמת בקרה
ננו-חלקיקי זהב 20 ננומטר	סיגמא-אולדריץ'	753610	משמש כדוגמת בקרה
Zyla 4.2 מצלמה	אנדור	זילה 4.2	2048x2048 פיקסלים (גודל פיקסל 6.5μm) עם יעילות קוונטית של 72% וטווח דינמי של 16bit
תוכנת מעקב Feista			https://www.bcube-dresden.de/ fiesta/wiki/FIESTA
מיקרוטובולים מיוצבים			מוכן בבית (ראה הפניות בטקסט)