מיקרוסקופ כוח אטומי סטטי להדמיה ואפיון של נוקלאוזומים מורכבים

Abstract

מקור: Stormberg, T., et al. חקירת המבנה והדינמיקה של נוקלאוזומים באמצעות דימות במיקרוסקופ כוח אטומי. J. Vis. Exp.(2019)

בסרטון זה אנו מדגימים מיקרוסקופ כוח אטומי סטטי כדי לדמיין נוקלאוזומים מורכבים. טכניקת הדמיה ברזולוציה גבוהה זו מאפשרת לחקור את מבנה הנוקלאוזומים.

Protocol

1. פונקציונאליזציה של משטח נציץ להדמיית AFM סטטית של נוקלאוזומים

1. הכן תמיסת מלאי APS של 50 mM 1-(3-Aminopropyl) silatrane במים נטולי יונים, כמתואר. אחסן 1 מ"ל aliquots של פתרון זה ב 4 °C עד לשימוש.
   הערה: aliquots ניתן לאחסן במשך יותר משנה ב 4 °C (75 °F).
2. הכן פתרון APS 1:300 עובד לשינוי נציץ על-ידי המסת 50 μL ממלאי APS של 50 mM ב- 15 mL dd H₂O.
   הערה: פתרון עבודה זה ניתן לאחסן בטמפרטורת החדר במשך מספר ימים.
3. חותכים רצועות נציץ בגודל 1X3 ס"מ מיריעות נציץ איכותיות (ראו טבלת חומרים לנציץ כאן).
   1. בדקו שהחתיכה מתאימה כאשר היא מונחת באלכסון בקוב....

Results

איור 1: סכמטיות של התהליך להכנת נציץ פונקציונלי APS עבור דימות AFM של נוקלאוזומים. (A) חתיכת נציץ בעובי ~0.1 מ"מ יש לשני הצדדים בקעים טריים. (B) חתיכת הנציץ השסוע מונחת מיד באלכסון בקובטה המכילה את תמיסת ה-APS ומוגדרת לדגירת הנציץ למשך 30 דקות. (C) לאחר שלב הפונקציונליות של APS, פיסת הנציץ של APS מועברת לקובטה מלאה ב-dd H2O לשטיפה של 30 שניות. (D) פיסת APS-mica מאוחסנת בקובט עד לשימוש.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
CENP-A/H4)2, אדם רקומביננטי	EpiCypher , דורהם, קרוליינה הצפונית	16-0010	מספר קטלוגי עבור 50 מ"ג
H2A/H2B, אדם רקומביננטי	EpiCypher , דורהם, קרוליינה הצפונית	15-0311	מספר קטלוגי עבור 50 מ"ג
H3 אוקטמר, אדם רקומביננטי	EpiCypher , דורהם, קרוליינה הצפונית	16-0001	מספר קטלוגי עבור 50 מ"ג
ערכת התקן דיאליזה MINI Slide-A-Lyzer, MWCO 10K, 0.1 מ"ל	ThermoFischer Scientific, וולת'הם, מסצ'וסטס	69574	מספר קטלוגי ל-10 מכשירים
נתרן כלורי	Sigma-Aldrich , סנט לואיס, מיזורי	S9888-500G	מספר קטלוגי עבור 500 מ"ג
Amicon Ultra-0.5 מ"ל מסננים צנטריפוגליים	Millipore-sigma , ברלינגטון, מיזורי	UFC501008	מספר קטלוגי ל-8 מכשירים
HCl	Sigma-Aldrich , סנט לואיס, מיזורי	258148-25 מ"ל	מק"ט עבור 25 מ"ל
טריצין	Sigma-Aldrich , סנט לואיס, מיזורי	T0377-25G	מספר קטלוגי עבור 25 גרם
SDS	Sigma-Aldrich , סנט לואיס, מיזורי	11667289001	מספר קטלוגי ל-1 ק"ג
אמוניום פרסולפט (AmmPS)	Bio-Rad , הרקולס, קליפורניה	1610700	מספר קטלוגי עבור 10 גרם
30% תמיסת אקרילאמיד/ביס, 37.5:1	Bio-Rad , הרקולס, קליפורניה	1610158	מק"ט עבור 500 מ"ל
טמד	Bio-Rad , הרקולס, קליפורניה	1610800	מק"ט עבור 5 מ"ל
4x מאגר דגימת חלבון Laemmli עבור SDS-PAGE	Bio-Rad , הרקולס, קליפורניה	1610747	מספר קטלוגי עבור 10 מ"ל
2-ME	Sigma-Aldrich , סנט לואיס, מיזורי	M6250-10ML	מספר קטלוגי עבור 10 מ"ל
ageRuler Prestained סולם חלבונים	ThermoFischer Scientific, וולת'הם, מסצ'וסטס	26616	מספר קטלוגי עבור 500 uL
כתם קומאסי בטוח™ ביולוגית	Bio-Rad , הרקולס, קליפורניה	1610786	מספר קטלוגי עבור 1 L
מגבונים לא ארוגים לחדר נקי: TX604 TechniCloth	TexWipe, Kernersvile , קרוליינה הצפונית	TX604
נציץ בלוק מוסקבאי	AshevilleMica , ניופורט ניוז, וירג'יניה	כיתה-א'
HEPES	Sigma-Aldrich , סנט לואיס, מיזורי	H4034-25G	מספר קטלוגי עבור 25 גרם
סקוטש טייפ	Scotch-3M , סנט פול, מינסוטה
בדיקת TESPA-V2 afm (להדמיה סטטית)	Bruker AFM Probes , קמרילו, קליפורניה
מסנן Millex-GP, 0.22 מיקרומטר	Sigma-Aldrich , סנט לואיס, מיזורי	SLGP05010	מספר קטלוגי ל-10 מכשירים
בדיקת AFM BL-AC10DS-A2 (עבור HS-AFM)	אולימפוס, יפן
מיקרוסקופ כוח אטומי MultiMode	Bruker-Nano/Veeco , סנטה ברברה, קליפורניה