מיקרוסקופ כוח אטומי סטטי להדמיה ואפיון של נוקלאוזומים מורכבים

Abstract

מקור: Stormberg, T., et al. חקירת המבנה והדינמיקה של נוקלאוזומים באמצעות דימות במיקרוסקופ כוח אטומי. J. Vis. Exp.(2019)

בסרטון זה אנו מדגימים מיקרוסקופ כוח אטומי סטטי כדי לדמיין נוקלאוזומים מורכבים. טכניקת הדמיה ברזולוציה גבוהה זו מאפשרת לחקור את מבנה הנוקלאוזומים.

Protocol

1. פונקציונאליזציה של משטח נציץ להדמיית AFM סטטית של נוקלאוזומים

1. הכן תמיסת מלאי APS של 50 mM 1-(3-Aminopropyl) silatrane במים נטולי יונים, כמתואר. אחסן 1 מ"ל aliquots של פתרון זה ב 4 °C עד לשימוש.
   הערה: aliquots ניתן לאחסן במשך יותר משנה ב 4 °C (75 °F).
2. הכן פתרון APS 1:300 עובד לשינוי נציץ על-ידי המסת 50 μL ממלאי APS של 50 mM ב- 15 mL dd H₂O.
   הערה: פתרון עבודה זה ניתן לאחסן בטמפרטורת החדר במשך מספר ימים.
3. חותכים רצועות נציץ בגודל 1X3 ס"מ מיריעות נציץ איכותיות (ראו טבלת חומרים לנציץ כאן).
   1. בדקו שהחתיכה מתאימה כאשר היא מונחת באלכסון בקובט. השתמשו בקצה של פינצטה חדה, סכין גילוח, או סקוטש טייפ, כדי לבקע שכבות של הנציץ עד ששני הצדדים נבקעים טריים והחתיכה דקה כמו ~0.1 מ"מ (איור 1A). הכניסו מיד את חתיכת הנציץ לקובט מלא APS ודגרו במשך 30 דקות (איור 1B).
4. העבירו את חתיכת הנציץ לקובטה מלאה ב-dd H2O והשרו במשך 30 שניות (איור 1C). יבש לחלוטין את שני הצדדים של רצועת APS-mica תחת זרימת ארגון.
   הערה: ניתן להשתמש במגבון חדר נקי עם תאית לא ארוגה ופוליאסטר (מגבון מומלץ המפורט בחומרים) כדי לסייע בפתילת מים מקצה הנציץ בעת הייבוש.
5. השתמשו כעת ברצועת הנציץ היבשה להכנת הדגימה. אחרת, אחסנו את החתיכה בקובט נקי ויבש (איור 1D).
   הערה: אחסון נוסף בשואב אבק למשך 1-2 שעות מומלץ כאשר הסביבה לחה. ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן.

2. הכנת דגימות נוקלאוזומים על APS-MICA להדמיית AFM סטטית

1. יש למרוח סרט הדבקה דו-פרצופי על מספר פאקים מגנטיים ולהניח אותם בצד.
2. חותכים את מצע הנציץ APS-Mica לגודל הרצוי (ריבועים בגודל 1X1 ס"מ עבור מכשיר MM AFM המשמש כאן). הניחו את החתיכות הללו בכלי פטרי נקי ושמרו אותן מכוסות.
3. הכינו שלושה דילולים של הנוקלאוזומים שהורכבו (ריכוזי נוקלאוזומים סופיים של 0.5, 1.0 ו-2.0 ננומטר) באמצעות מאגר מסונן של 0.22 מיקרומטר המכיל 10 mM HEPES pH 7.5 ו-4 mM MgCl₂.
   הערה: כדי להגביל את אובדן הנוקלאוזומים בריכוז הסופי הנמוך, יש לבצע את הדילולים אחד בכל פעם, מיד לפני השיקוע על APS-mica.
4. הפקידו 5-10 μL של דגימת הנוקלאוזומים המדוללת במרכז חתיכת APS-mica, ותנו לה לדגור במשך שתי דקות. שטפו בעדינות את הדגימה עם 2-3 מ"ל של dd H₂O כדי להסיר את כל רכיבי החיץ. לאחר כל ~ 0.5 מ"ל של dd H₂O משמש, לנער בעדינות את הנציץ כדי להסיר את עודפי מי השטיפה.
   הערה: מזרק חד פעמי מומלץ לשלב שטיפה זה.
5. יבש את הדגימה שהושקעה תחת זרימה קלה של גז ארגון נקי.
   הערה: הדגימה מוכנה כעת לצילום או שניתן לאחסן אותה בארון ואקום או מייבש מלא ארגון. דגימות שהוכנו ואוחסנו כמתואר צולמו שנה לאחר ההכנה ללא אובדן איכות. ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן.

3. דימות AFM סטטי של נוקלאוזומים

1. הרכיבו קצה AFM על מחזיק הקצה. השתמש בחוד בעל קבוע קפיץ של ~40 N/m ותדר תהודה בין 300 ל -340 קילוהרץ (ראה טבלת החומרים עבור המכלים המשמשים כאן).
2. הרכיבו את הדגימה שהוכנה בסעיף 3 על במת AFM תוך זהירות שלא לגעת במשטח הדגימה.
3. מקם את הלייזר מעל הקנטיל עד שהסכום יגיע למקסימום והתאם את ערכי הסטייה האנכית והצידית קרוב לאפס.
4. כוונן את הגשושית AFM כדי למצוא את תדר התהודה שלה וכוונן את משרעת הכונן והגדר את גודל התמונה ל- 100 x 100 ננומטר. לחץ על לחצן המעורבות כדי להתחיל בגישה.
5. לאחר התקרבות, מטב בהדרגה את נקודת המשרעת עד שפני השטח של הדגימה נראים בבירור. הגדל את גודל הסריקה ל- 1 x 1 מיקרומטר ואת הרזולוציה ל- 512 x 512 פיקסלים. לחץ על לחצן הלכידה ואחריו על לחצן המעורבות כדי להתחיל ברכישת תמונה.
   הערה: התמונות באיור 2 מראות את הרקע החלק שניתן לצפות לו בעת הדמיה של הדגימות האלה.

Results

איור 1: סכמטיות של התהליך להכנת נציץ פונקציונלי APS עבור דימות AFM של נוקלאוזומים. (A) חתיכת נציץ בעובי ~0.1 מ"מ יש לשני הצדדים בקעים טריים. (B) חתיכת הנציץ השסוע מונחת מיד באלכסון בקובטה המכילה את תמיסת ה-APS ומוגדרת לדגירת הנציץ למשך 30 דקות. (C) לאחר שלב הפונקציונליות של APS, פיסת הנציץ של APS מועברת לקובטה מלאה ב-dd H2O לשטיפה של 30 שניות. (D) פיסת APS-mica מאוחסנת בקובט עד לשימוש.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
CENP-A/H4)2, אדם רקומביננטי	EpiCypher , דורהם, קרוליינה הצפונית	16-0010	מספר קטלוגי עבור 50 מ"ג
H2A/H2B, אדם רקומביננטי	EpiCypher , דורהם, קרוליינה הצפונית	15-0311	מספר קטלוגי עבור 50 מ"ג
H3 אוקטמר, אדם רקומביננטי	EpiCypher , דורהם, קרוליינה הצפונית	16-0001	מספר קטלוגי עבור 50 מ"ג
ערכת התקן דיאליזה MINI Slide-A-Lyzer, MWCO 10K, 0.1 מ"ל	ThermoFischer Scientific, וולת'הם, מסצ'וסטס	69574	מספר קטלוגי ל-10 מכשירים
נתרן כלורי	Sigma-Aldrich , סנט לואיס, מיזורי	S9888-500G	מספר קטלוגי עבור 500 מ"ג
Amicon Ultra-0.5 מ"ל מסננים צנטריפוגליים	Millipore-sigma , ברלינגטון, מיזורי	UFC501008	מספר קטלוגי ל-8 מכשירים
HCl	Sigma-Aldrich , סנט לואיס, מיזורי	258148-25 מ"ל	מק"ט עבור 25 מ"ל
טריצין	Sigma-Aldrich , סנט לואיס, מיזורי	T0377-25G	מספר קטלוגי עבור 25 גרם
SDS	Sigma-Aldrich , סנט לואיס, מיזורי	11667289001	מספר קטלוגי ל-1 ק"ג
אמוניום פרסולפט (AmmPS)	Bio-Rad , הרקולס, קליפורניה	1610700	מספר קטלוגי עבור 10 גרם
30% תמיסת אקרילאמיד/ביס, 37.5:1	Bio-Rad , הרקולס, קליפורניה	1610158	מק"ט עבור 500 מ"ל
טמד	Bio-Rad , הרקולס, קליפורניה	1610800	מק"ט עבור 5 מ"ל
4x מאגר דגימת חלבון Laemmli עבור SDS-PAGE	Bio-Rad , הרקולס, קליפורניה	1610747	מספר קטלוגי עבור 10 מ"ל
2-ME	Sigma-Aldrich , סנט לואיס, מיזורי	M6250-10ML	מספר קטלוגי עבור 10 מ"ל
ageRuler Prestained סולם חלבונים	ThermoFischer Scientific, וולת'הם, מסצ'וסטס	26616	מספר קטלוגי עבור 500 uL
כתם קומאסי בטוח™ ביולוגית	Bio-Rad , הרקולס, קליפורניה	1610786	מספר קטלוגי עבור 1 L
מגבונים לא ארוגים לחדר נקי: TX604 TechniCloth	TexWipe, Kernersvile , קרוליינה הצפונית	TX604
נציץ בלוק מוסקבאי	AshevilleMica , ניופורט ניוז, וירג'יניה	כיתה-א'
HEPES	Sigma-Aldrich , סנט לואיס, מיזורי	H4034-25G	מספר קטלוגי עבור 25 גרם
סקוטש טייפ	Scotch-3M , סנט פול, מינסוטה
בדיקת TESPA-V2 afm (להדמיה סטטית)	Bruker AFM Probes , קמרילו, קליפורניה
מסנן Millex-GP, 0.22 מיקרומטר	Sigma-Aldrich , סנט לואיס, מיזורי	SLGP05010	מספר קטלוגי ל-10 מכשירים
בדיקת AFM BL-AC10DS-A2 (עבור HS-AFM)	אולימפוס, יפן
מיקרוסקופ כוח אטומי MultiMode	Bruker-Nano/Veeco , סנטה ברברה, קליפורניה