מיקרוסקופ כוח אטומי בהילוך מהיר ללכידת דינמיקה של נוקלאוזומים

תקציר

מקור: Stumme-Diers, M. P., et al., חקירת המבנה והדינמיקה של נוקלאוזומים באמצעות דימות מיקרוסקופ כוח אטומי.J. Vis. Exp.(2019)

בסרטון זה, אנו מדגימים מיקרוסקופ כוח אטומי בהילוך מהיר בהילוך מהיר, AFM, טכניקות הדמיה כדי לחקור את הדינמיקה של קומפלקסים נוקלאוזומים. כאשר קצה ה-AFM סורק את פני השטח של הנוקלאוזום, הוא מזהה שינויים בגובה הנוקלאוזומים ורושם את הדנ"א שנחשף לאורך זמן.

פרוטוקול

1. מכלול דילול רציף של מונו-נוקלאוזומים

1. ליצור ולטהר מצע DNA של כ-400 bp המכיל רצף מיקום נוקלאוזומים Widom 601 לא ממורכז.
   הערה: כדי להגביל את היווצרותם הבלתי רצויה של די-נוקלאוזומים, כל "זרוע" המאגפת את רצף המיקום לא תעלה על ~150 bp.
   1. השתמש פלסמיד pGEM3Z-601 יחד עם פריימרים מעוצבים ולהגביר את DNA המצע באמצעות PCR. עבור מצע 423 bp עם אורכי זרוע של 122 ו- 154 bp המשמשים כאן, השתמש בפריימרים קדימה (5'-CAGTGAATTGTAATACGACTC-3') והפוך (5'-ACAGCTATGACCATGATTAC-3').
   2. הוסף צינורות המכילים את תערובת התגובה למחזור תרמי שחומם מראש ל- 95 ° C. הפעל את התוכנית הבאה במשך 33 מחזורים לאחר דנטורציה ראשונית למשך 5 דקות ב- 95 ° C: 30 שניות דנטורציה ב- 95 ° C, 30 שניות חישול ב- 49 ° C ו- 35 שניות הארכה ב- 72 ° C. הגדר הארכה סופית ב- 72 ° C למשך 10 דקות לאחר 33 המחזורים.
   3. טהרו את הדנ"א מתערובת ה-PCR באמצעות ערכת טיהור PCR הזמינה מסחרית. בעת הוצאת הדנ"א מעמודת ניקוי ה-PCR, השתמש במאגר Tris של 10 mM (pH 7.5) במקום מאגר ה-elution שסופק על-ידי הערכה.
      הערה: יש להקפיד במיוחד שלא להעביר מאגרים בין שלבי הטיהור. אלואנט מזוהם יכול לגרום לבעיות במורד הזרם בעת מדידת ריכוז ה- DNA ו / או יכול לשנות את ריכוז המלח ההתחלתי של תערובת הרכבת הנוקלאוזום.
2. לקבוע את ריכוז ה- DNA על ידי מדידת הספיגה של DNA מטוהר ב 260 ננומטר.
   1. אסוף ריק על ספקטרופוטומטר UV VIS באמצעות מאגר 10 mM Tris pH 7.5 elution בלבד. אספו מדידה של הדנ"א המטוהר.
3. עם ריכוז שנקבע, aliquot 25 pmol של ה- DNA מטוהר לתוך צינור microfuge 0.6 מ"ל ומניחים אותו בצנטריפוגת ואקום עד התמיסה בקושי גלוי; זה בדרך כלל 30 דקות עד 1 h.
   הערה: מצע הדנ"א מוכן כעת להרכבת נוקלאוזומים. אחרת, ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן ולאחסן את הדנ"א בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס עד לשימוש.
4. הניחו את צינור המיקרופוגה המכיל את הדנ"א של 25 pmol על הקרח והוסיפו את רכיבי הרכבת הנוקלאוזומים בטבלה 1, בסדר הרשום. לאחר הוספת כל הרכיבים, הסירו את התערובת מהקרח ודגרו בטמפרטורת החדר (RT) למשך 30 דקות
   הערה: זה קריטי כי תכולת המלח של חיץ היסטון מלאי נלקח בחשבון בעת חישוב NaCl הדרוש כדי להשיג את הריכוז הסופי 2 M.
5. הרכבת הנוקלאוזומים על ידי הפחתת ריכוז המלח של 2 M של התערובת ל 200 mM באמצעות דילול קצב רציף.
   1. ממלאים מזרק ב-100 מיקרוליטר של חיץ דילול המכיל 10 mM Tris pH 7.5 ומניחים אותו על משאבת מזרק.
   2. כוונו את מחט המזרק דרך חור מנוקב מראש בפקק של צינור המיקרופוגה, וודאו שנוצר מגע עם תערובת ההרכבה (איור 1).
   3. הפעל את משאבת המזרק בקצב של 0.75 מיקרוליטר/דקה למשך 120 דקות.
      הערה: הפתרון המתקבל 100 μL מכיל 250 ננומטר נוקלאוזומים ו 200 mM NaCl.
   4. העבירו את התערובת ללחצן דיאליזה MWCO 10K ונטרלו כנגד 200 מ"ל של מאגר מלח נמוך מקורר מראש (4°C) המכיל 10 mM Tris pH 7.5, 0.25 mM EDTA ו-2.5 mM NaCl, למשך שעה אחת ב-4°C.
6. כדי להעריך את תכולת ההיסטון של מכלול הנוקלאוזום, הכינו ג'ל SDS-PAGE לא רציף עם הפרדה של 15% והערמה של 6% כפי שתואר קודם לכן.
   1. Aliquot 10 - 20 μL של מלאי הנוקלאוזומים לצינור microfuge ולהוסיף 4x Laemmli דגימה חיץ לריכוז עבודה של 1 - 2x.
   2. כבקרה, חזור על הכנה זו בצינור מיקרופוגה נפרד עבור 1 - 2 מיקרוגרם של מלאי היסטון. חממו את הדגימות בטמפרטורה של 95°C למשך ~5 דקות.
   3. העמיסו את הדגימות בנתיבים סמוכים זו לזו על הג'ל. הוסף מאגר לדוגמה לנתיבים שאינם בשימוש כדי לקדם העברת פס אחידה.
   4. מעבירים את הג'ל במתח של 65 וולט עד שחזית הצבע עוברת דרך ג'ל הערימה. כאשר מגיעים לג'ל המפריד, מגדילים אותו ל-150 וולט ורצים עד שחזית הצבע נודדת לחלוטין החוצה מהג'ל.
   5. יש לפרק את יחידת האלקטרופורזה ולהעביר בעדינות את הג'ל למיכל צביעה מלא dd H₂O. תן לג'ל לשבת במשך 5 דקות עם תסיסה עדינה. חזור על תהליך זה פעמיים נוספות עם dd H₂O טרי בשימוש בכל פעם.
      הערה: כתם קומאסי המשמש בפרוטוקול זה אינו דורש את שלבי התיקון האופייניים הדרושים לכתמי קומאסי (ראה טבלת חומרים). אם נעשה שימוש בתכשיר קומאסי נוסף, התאימו את שלבי התיקון לפי הצורך.
   6. מוציאים את המים מהשטיפה הסופית ומוסיפים מספיק כתם כדי לכסות את הג'ל. תן לג'ל לשבת עם תסיסה עדינה לפחות 1 h.
      הערה: עבור התסיסה, ניתן להניח את מיכל הצביעה על כל מכשיר המקדם תנועה של הכתם מעל הג'ל תוך שמירה על הג'ל מכוסה בנוזל.
   7. הסר את הכתם מהמיכל ושטוף את הג'ל עם dd H₂O. החלף את dd H₂O והשרה את הג'ל למשך 30 דקות בתסיסה עדינה. (הג'ל אמור להיראות כמו זה שמוצג באיור 2, עם הפרדה ברורה של רצועות ההיסטון.)
7. יש לאחסן את הנוקלאוזומים בטמפרטורה של 4°C עד לשימוש.
   הערה: כאשר הם מאוחסנים בתנאים אלה, הנוקלאוזומים נשארים יציבים במשך מספר חודשים. ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן.

2. דימות AFM בהילוך מהיר של דינמיקת נוקלאוזומים

הערה: הפרוטוקול להלן מסופק עבור מכשיר HS-AFM שפותח על ידי קבוצת אנדו (אוניברסיטת קאנאזאווה, קאנאזאווה, יפן).

1. הכן את APS-mica להדמיית נוזלים.
   1. חבר את מוט הזכוכית לשלב סורק AFM באמצעות דבק מוט-סורק זכוכית (ראה טבלת חומרים). תן לזה להתייבש במשך מינימום של 10 דקות.
   2. הכינו ~ 0.1 מ"מ חתיכות עגולות של נציץ בקוטר 1.5 מ"מ על ידי ניקוב אותן מגיליון נציץ גדול יותר. השתמש בדבק מוט זכוכית נציץ HS-AFM (ראה טבלת חומרים) כדי לחבר פיסת נציץ זו למוט הזכוכית ב- HS-AFM ולייבש, ללא מגע למשך 10 דקות לפחות. חותכים שכבות באמצעות סרט רגיש ללחץ עד שנראית שכבה שסועה
   .
   3. לדלל 1 μL של מלאי APS של 50 mM ב 99 μL של dd H₂O כדי ליצור פתרון APS של 500 מיקרומטר. הפקידו 2.5 מיקרוליטר של תמיסה זו על משטח נציץ שזה עתה נבקע ותנו לו לתפקד למשך 30 דקות
      הערה: כדי למנוע התייבשות של המשטח בזמן תפקוד, ניתן להתאים את המכסה של צינור צנטריפוגה חרוטי 50 מ"ל עם פיסת נייר סינון לחה ולהניח מעל הסורק. מלאי APS מדולל פי 3 פחות עבור הדמיה נוזלית מאשר עבור הדמיה סטטית כדי לשלוט בדינמיקה בקצב שניתן לצפות בו עם AFM.
   4. יש לשטוף את הנציץ עם 20 μL של dd H₂O על ידי החלת מספר ~ 3 μL שטיפות. יש להסיר את המים לחלוטין לאחר כל שטיפה על ידי הנחת מגבון לא ארוג בקצה הנציץ. לאחר השטיפה הסופית, הניחו ~ 3 μL של dd H₂O על פני השטח והניחו לו לשבת לפחות 5 דקות כדי להסיר APS שאינו קשור ספציפית.
2. מקם את הגשושית במחזיק HS-AFM ומקם את המחזיק על במת AFM כשהקצה פונה כלפי מעלה. יש לשטוף את המחזיק באמצעות ~100 μL של dd H₂O ואחריו שתי שטיפות ~100 μL של מאגר הדמיה של נוקלאוזומים מסוננים 0.22 מיקרומטר, המכיל 10 mM HEPES pH 7.5 ו-4 mM MgCl₂.
3. עם ביצוע השטיפות, מלא את החדר עם ~ 100 μL של מאגר הדמיה נוקלאוזום, שקוע בקצה. כוונן את מיקום המגן עד שהוא נפגע עם הלייזר. יש לשטוף את הנציץ APS-עם 20 μL של מאגר הדמיה נוקלאוזומי מסונן, באמצעות ~4 μL לכל שטיפה.
4. יש לדלל 1 μL ממלאי הרכבת הנוקלאוזומים ל-250 μL של מאגר הדמיה נוקלאוזומי מסונן לקבלת ריכוז נוקלאוזומים סופי של 1 ננומטר. הפקידו 2.5 μL של דילול זה על פני השטח ולתת לו לשבת במשך 2 דקות. יש לשטוף את פני השטח עם ~ 4 μL של מאגר הדמיה נוקלאוזומי פעמיים. לאחר השטיפה הסופית, השאירו את המשטח מכוסה במאגר ההדמיה.
   הערה: אם המשטח אינו נשטף לאחר הפקדת דגימת הנוקלאוזומים, המשטח יהפוך במהירות לצפוף.
5. הניחו את הסורק והדגימה מעל מחזיק הקצה כך שהדגימה תהיה עם הפנים כלפי מטה. כדי להתחיל את הגישה, השתמש בפונקציית הגישה האוטומטית עם משרעת נקודה מוגדרת, A_s קרוב למשרעת התנודה החופשית A₀.
   הערה: באופן אידיאלי, A_s = 0.95 A₀, לעומת זאת, פעולה ב 82% של A₀ יעבוד גם אם זהיר.
6. התאם את נקודת ההגדרה עד שהמשטח יהיה במעקב טוב.
   הערה: כדי למזער את העברת האנרגיה מקצה AFM לדגימת הנוקלאוזומים, המשרעת של הקנטיל צריכה להישמר קטנה, עם אמפליטודות נמוכות עד 1 ננומטר אופטימלי.
7. הגדר את אזור התמונה סביב 150 x 150 ננומטר עד 200 x 200 ננומטר עם קצב איסוף נתונים של ~300 אלפיות השנייה לכל מסגרת הדמיה.
   הערה: גודל תמונה זה מספיק בדרך כלל כדי ללכוד את הדינמיקה של מספר נוקלאוזומים בו זמנית. משטח פחות מאוכלס עשוי לדרוש שינויים בפרמטרים אלה. קצב המסגרות המוצע מספיק כדי ללכוד דינמיקה של נוקלאוזומים כגון לולאה, החלקה והסרת עטיפה, בין היתר (ראה סעיף תוצאות מייצגות להלן).

טבלה 1: ריאגנטים הדרושים להרכבת נוקלאוזומים הדרגתיים רציפים של מלח. כל אחד מהרכיבים המפורטים מתווסף לצינור המיקרופוגה המכיל את הדנ"א המטוהר. זה צריך להיעשות בסדר שבו ריאגנטים רשומים בטבלה, עם מים NaCl הוסיף הראשון, ואחריו דימר H2A / H2B ואת טטרמר היסטון הוסיף אחרון. אם רוצים להשתמש באוקטמרים היסטון מקופלים מראש, הוסיפו אותם באותו יחס כמו עבור הטטרמר לעיל. *שימו לב לתכולת ה-NaCl בכל אחד ממלאי ההיסטון והתאימו את ה-NaCl של 5M כך שהוספה בהתאם, [NaCl] הסופי צריך להיות שווה ל-2M. (ראו טבלת חומרים).

תוצאות

איור 1: סכמה של משאבת המזרק המשמשת להרכבת נוקלאוזומים בקנה מידה מיקרו.תערובת ההרכבה ממוקמת במגע עם קצה מחט המזרק. כאשר חיץ הדילול מועבר על ידי משאבת המזרק לתערובת ההרכבה, ריכוז NaCl יורד, מה שמקדם הרכבת נוקלאוזומים. נתון זה נלקח מ Stumme-Diers et al.

איור 2: SDS-PAGE של נוקלאוזומים מורכבים. נתיבים 1 ו-2 מכיל...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
פלסמיד pGEM3Z-601	אדג'ין, קיימברידג', מסצ'וסטס	26656
פריימרים ל-PCR	IDT, קוראלוויל, IA	הזמנה מותאמת אישית	(FP) 5'- CAGTGAATTGTAATACGACTC-3' (RP) 5'-ACAGCTATGACCATGATTAC-3'
DreamTaq פולימראז	ThermoFischer Scientific, וולת'הם, מסצ'וסטס	EP0701	מספר קטלוגי ל-200 יח'
ערכת טיהור PCR	Qiagen, Hilden, גרמניה	28104	מספר קטלוגי ל-50 יחידות
בסיס טריס	Sigma-Aldrich , סנט לואיס, מיזורי	10708976001	מספר קטלוגי עבור 250 גרם
EDTA	ThermoFischer Scientific, וולת'הם, מסצ'וסטס	15576028	מספר קטלוגי עבור 500 גרם
(CENP-A/H4)2, אדם רקומביננטי	EpiCypher , דורהם, קרוליינה הצפונית	16-0010	מספר קטלוגי עבור 50 מ"ג
H2A/H2B, אדם רקומביננטי	EpiCypher , דורהם, קרוליינה הצפונית	15-0311	מספר קטלוגי עבור 50 מ"ג
H3 אוקטמר, אדם רקומביננטי	EpiCypher , דורהם, קרוליינה הצפונית	16-0001	מספר קטלוגי עבור 50 מ"ג
ערכת התקן דיאליזה MINI Slide-A-Lyzer, MWCO 10K, 0.1 מ"ל	ThermoFischer Scientific, וולת'הם, מסצ'וסטס	69574	מספר קטלוגי ל-10 מכשירים
נתרן כלורי	Sigma-Aldrich , סנט לואיס, מיזורי	S9888-500G	מספר קטלוגי עבור 500 מ"ג
Amicon Ultra-0.5 מ"ל מסננים צנטריפוגליים	Millipore-sigma , ברלינגטון, מיזורי	UFC501008	מספר קטלוגי ל-8 מכשירים
HCl	Sigma-Aldrich , סנט לואיס, מיזורי	258148-25 מ"ל	מק"ט עבור 25 מ"ל
טריצין	Sigma-Aldrich , סנט לואיס, מיזורי	T0377-25G	מספר קטלוגי עבור 25 גרם
SDS	Sigma-Aldrich , סנט לואיס, מיזורי	11667289001	מספר קטלוגי ל-1 ק"ג
אמוניום פרסולפט (AmmPS)	Bio-Rad , הרקולס, קליפורניה	1610700	מספר קטלוגי עבור 10 גרם
30% תמיסת אקרילאמיד/ביס, 37.5:1	Bio-Rad , הרקולס, קליפורניה	1610158	מק"ט עבור 500 מ"ל
טמד	Bio-Rad , הרקולס, קליפורניה	1610800	מק"ט עבור 5 מ"ל
4x מאגר דגימת חלבון Laemmli עבור SDS-PAGE	Bio-Rad , הרקולס, קליפורניה	1610747	מספר קטלוגי עבור 10 מ"ל
2-ME	Sigma-Aldrich , סנט לואיס, מיזורי	M6250-10ML	מספר קטלוגי עבור 10 מ"ל
סולם חלבונים של PageRuler Prestained	ThermoFischer Scientific, וולת'הם, מסצ'וסטס	26616	מספר קטלוגי עבור 500 uL
כתם קומאסי בטוח™ ביולוגית	Bio-Rad , הרקולס, קליפורניה	1610786	מספר קטלוגי עבור 1 L
מגבונים לא ארוגים לחדר נקי: TX604 TechniCloth	TexWipe, Kernersvile , קרוליינה הצפונית	TX604
נציץ בלוק מוסקבאי	AshevilleMica , ניופורט ניוז, וירג'יניה	כיתה-א'
Aminopropyl silatrane (APS)	מסונתז כמתואר ב 22
HEPES	Sigma-Aldrich , סנט לואיס, מיזורי	H4034-25G	מספר קטלוגי עבור 25 גרם
סקוטש טייפ	Scotch-3M , סנט פול, מינסוטה
אהרון אלפא תעשייתי Krazy דבק	טואגוסיי אמריקה, ווסט ג'פרסון, אוהיו	AA480	מספר קטלוגי לשפופרת 2 גרם
MgCl2	Sigma-Aldrich , סנט לואיס, מיזורי	M8266-100G	מספר קטלוגי עבור 100 גרם
מסנן Millex-GP, 0.22 מיקרומטר	Sigma-Aldrich , סנט לואיס, מיזורי	SLGP05010	מספר קטלוגי ל-10 מכשירים
בדיקת AFM BL-AC10DS-A2 (עבור HS-AFM)	אולימפוס, יפן
תרכובת FG-3020C-20	FluoroTechnology ושות', בע מ, Kagiya, Kasugai, Aichi, יפן
תרכובת FS-1010S135-0.5	FluoroTechnology ושות', בע מ, Kagiya, Kasugai, Aichi, יפן
מיקרוסקופיית כוח אטומי בהילוך מהיר	טושיו אנדו, המכון לננו-מדעי החיים, אוניברסיטת קאנאזאווה, קאקומה-מאצ'י, קנזאווה, יפן