$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
כל ההליכים המערבים משתתפים אנושיים בוצעו בהתאם להנחיות המוסדיות, הלאומיות והבינלאומיות לרווחת האדם ונבחנו על ידי ועדת הבדיקה המוסדית המקומית
1. קיבוע ראשוני, פוסט-קיבוע, הטבעה, חתך וניגוד
- הכן 1.6 מ"ל של תמיסה קיבוע ראשונית (2.5% גלוטראלדהיד במאגר נתרן קקודילט 0.1 M (pH 7.3)) בצינור מיקרו צנטריפוגה של 2 מ"ל. יש לאחסן אותו בטמפרטורה של 5°C למשך 14 ימים לכל היותר.
- מתוך ביופסיית השריר או שריר שלם, בודדו דגימה קטנה, בעלת קוטר מקסימלי של 1 מ"מ לכל כיוון והיא מעט ארוכה יותר בכיוון הסיב האורכי מאשר בחתך רוחב (למטרות התמצאות).
- הניחו את הדגימה בצינור המכיל את תמיסת הקיבוע הראשונית הקרה. אחסנו אותו בטמפרטורה של 5°C למשך 24 שעות.
- שטפו את הדגימה ארבע פעמים (15 דקות בין כל כביסה) במאגר נתרן קקודילט 0.1 מ' (pH 7.3). באמצעות פיפטות העברה, הסר את החיץ המשומש מהצינור והשאיר את הדגימה ללא פגע, ולאחר מכן הוסף את המאגר הטרי.
הערה: לאחר השטיפה הסופית, ניתן לאחסן את הדגימה במאגר נתרן קקודילט 0.1 M ב 5 ° C במשך מספר חודשים. ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן.
- Postfix עם 1% osmium tetroxide (OsO4) ו 1.5% אשלגן ferrocyanide (K4Fe (CN)6) ב 0.1 M נתרן cacodylate buffer (pH 7.3) במשך 120 דקות ב 4 ° C.
הערה: השימוש באשלגן פרוציאניד 1.5% (K4Fe(CN)6) חיוני לניגוד אופטימלי של חלקיקי גליקוגן.
- יש לשטוף פעמיים במים מזוקקים פעמיים בטמפרטורת החדר (RT).
- יש לייבש על ידי טבילה בסדרה מדורגת של אלכוהול (אתנול) ב-RT בריכוזים הבאים: 70% (10 דקות), 70% (10 דקות), 95% (10 דקות), 100% (10 דקות) ו-100% (10 דקות).
הערה: בכל שלב, הדגימה שקועה באתנול, אשר לאחר מכן מוסר רק באופן חלקי כדי למנוע ייבוש הדגימה. לבסוף, שאריות אתנול הוא זרק.
- יש לחדור לתערובות מדורגות של פרופילן אוקסיד ושרף אפוסידי ב-RT באמצעות יחסי הנפח הבאים (פרופילן אוקסיד/שרף אפוסידיצי): 1/0 (10 דקות), 1/0 (10 דקות), 3/1 (45 דקות), 1/1 (45 דקות), 1/3 (45 דקות), 0/1 (ללילה). למחרת, הטמיעו דגימות בשרף אפוסידי 100% טרי בתבניות ופילמרי בטמפרטורה של 60°C למשך 48 שעות.
- חתכו מקטעים דקים במיוחד (60-70 ננומטר) של סיבים בעלי אוריינטציה אורכית ואספו אותם על רשתות נחושת בעלות חור אחד באופן הבא.
- הרכיבו את גוש הדגימה על מחזיק האולטרה-מיקרוטום.
- חותכים את הבלוק על פני השטח עם סכין גילוח על מנת להגיע לגובה הרקמה.
- הרכיבו סכין יהלום (Ultra cut 45) לפני הדגימה ויישרו את משטח הדגימה במקביל לסכין.
- הפק חתך דק למחצה (1 מיקרומטר) עם סכין היהלום כדי לבדוק את כיוון הדגימה. מכתימים את החלק הדק למחצה בכחול טולוידין לתצפית במיקרוסקופ אור.
- חתוך את הבלוק עוד יותר כדי להקטין את שטח העניין על מנת לקבל חלקים אולטרה דקים מתאימים.
- חותכים חלקים דקים במיוחד (60-70 ננומטר) עם סכין יהלום שנייה (Ultra cut 45).
- אסוף 1-2 חלקים על רשתות נחושת בעלות חור אחד באמצעות Perfect Loop.
הערה: לרשת נחושת בעלת חור אחד יש חור יחיד באמצע עם פורמבר התומך בקרום.
- יש להשוות חלקים עם אורניל אצטט ועופרת ציטראט על ידי טבילת הרשתות הנ"ל בתמיסת אורניל אצטט (0.5% במים מזוקקים כפול) למשך 20 דקות, ולאחר מכן בתמיסת עופרת ציטראט (1% במים מזוקקים כפולים) למשך 15 דקות. שטפו את הרשתות במים מזוקקים פעמיים בין שני הכתמים ואחריהם.
הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן.
2. הדמיה
- הפעל את מיקרוסקופ אלקטרונים שידור (מופעל במתח מואץ של 80 קילו וולט), מחשב ותוכנת הקלטת תמונה. הקלט תמונות דיגיטליות באמצעות מצלמת CCD דיגיטלית לסריקה איטית של 2 k x 2 k ותוכנת ההדמיה המשויכת.
- הכנס את הרשת עם מקטעים מרובים בשלב המיקרוסקופ.
- מסך את הרשת בתחילה בהגדלה נמוכה (למשל, x100) כדי לקבוע את איכות המקטעים (כלומר, חורים בקרום התומך, פסולת וכו ') ובחר את המקטעים האיכותיים ביותר. בהגדלה נמוכה, לקבוע את כיוון סיבי השריר.
- לאחר מכן, להגדיל את ההגדלה עם הקרן ממורכז על סיב היקפי בקטע. מקדו את התמונה בהגדלה מעל 30k כדי להבטיח מספיק פרטים עדינים בתמונה, בהנחיית טרנספורמציית פורייה מהירה בזמן אמת, אם קיימת. לבסוף, הקלט תמונות עם זמן חשיפה של שנייה אחת בהגדלה הרצויה.
- רכשו בסך הכל 24 תמונות של סיב שנבחר באופן אקראי, כלומר 12 תמונות של החלל המיופיברילרי ו-12 תמונות של החלל הסובסרקולמלי, בהגדלה בין 10 k ל-40 k. ודאו שהתמונות מפוזרות לאורכו ולרוחבו של הסיב בסדר אקראי אך שיטתי כדי לקבל תוצאות בלתי משוחדות (איור 1A).
הערה: ההגדלה האופטימלית תלויה ברזולוציית המצלמה הזמינה ובגודל המיקרוגרפים. המטרה היא להגיע לרזולוציה סופית, שבה ניתן למדוד את קוטר חלקיקי הגליקוגן בצעדים של 1 ננומטר, ולכלול שטח כולל של האזור המיופיברילרי של לפחות 70 מיקרומטר2 ואורך כולל של הסיב של לפחות 25 מיקרומטר המחולק ל-12 תמונות של החלל המיופיברילרי ו-12 תמונות של החלל הסובסרקולמלי לסיב, בהתאמה. סביר להניח ש-24 התמונות לכל סיב יתנו דיוק (מקדם טעות) של התוכן הנפחי של מאגרי הגליקוגן השונים בין 0.1 ל-0.2 בסיבים בודדים משרירי השלד של בני אדם, חולדות ועכברים (איור 2E).
- חזור על שלבים 2.4 ו- 2.5 עד לקבלת תמונה כוללת של 6-10 סיבים. במידת הצורך, חתכו מקטעים נוספים (מופרדים בלפחות 150 מיקרומטר כדי למנוע חפיפה של סיבים שכבר צולמו) וחזרו על שלבים 1.9-2.5.
3. ניתוחי תמונות
- ייבא תמונות ל- ImageJ על ידי לחיצה על File > Open.
- הגדר את קנה המידה הכללי כך שיתאים לגודל המקורי של התמונה על-ידי לחיצה על נתח > הגדר קנה מידה.
- התקרב ב- 100% על ידי לחיצה על תמונה > זום > פנימה.
- מדדו את העובי של דיסק Z אחד לכל תמונה של החלל המיופיברילרי (12 לסיבים) בעזרת הכלי קו ישר מתפריט 'כלים' (איור 1D). חשב את עובי דיסק Z הממוצע של כל אחד 6-10 סיבים.
- הגדירו 2-3 סיבים עם דיסק Z הממוצע העבה ביותר כסיבים מסוג 1 ו-2-3 סיבים עם דיסק Z הממוצע הדק ביותר כסיבים מסוג 2. התעלמו מסיבי הביניים 2-4 לניתוחים נוספים (איור 1E).
הערה: השלבים הבאים חוזרים על עצמם עבור כל אחד מ-4-6 הסיבים מהדגימה. שברי נפח הגליקוגן נאמדים על ידי ספירת נקודות. גודל הרשתות נבחר כדי לקבל דיוק גבוה משביע רצון של האומדנים. זה מתקבל לעתים קרובות על ידי השגת 250 להיטים, אשר לאחר מכן מכתיב את המספר הכולל של נקודות הדרושות, בתורו, את השטח לכל נקודה.
- השתמשו בכלי קו מקוטע כדי למדוד את אורך המיופיבריל החיצוני ביותר הנראה ממש מתחת לאזור הסוב-סרקולמלי (איור 2A).
הערה: אורך זה משמש לביטוי גליקוגן תת-סרקולמלי לכל שטח פנים (כלומר, אורך המיופיבריל החיצוני ביותר כפול עובי הקטע (60 ננומטר); ראה שלב 4.5). לכן, רק האזור subsarcolemmal, אשר מיוצג על ידי אורך זה, נכלל בניתוח.
- הכנס רשת על-ידי לחיצה על Analyze > Tools > Grid והגדר שטח לנקודה ב- 32,400 nm2. ספרו את מספר הפגיעות באורך הזמין ב-12 התמונות הסוב-סרקולמליות, שבהן צלב פוגע בגליקוגן התת-סרקולמלי (איור 2A). פגיעה מוגדרת כחלקיק גליקוגן הנמצא בפינה הימנית העליונה של הצלב.
- הוסף רשת על-ידי לחיצה על Analyze > Tools > Grid והגדר שטח לנקודה ב- 160,000 nm2. ספרו את מספר הפגיעות ב-12 התמונות המיופיברילריות, כאשר צלב פוגע במרחב התוך-מיופיברילרי (איור 2B).
- הוסף רשת על-ידי לחיצה על Analyze > Tools > Grid והגדר שטח לנקודה ב- 3,600 nm2. ספרו את מספר הפגיעות ב-12 התמונות המיופיברילריות, כאשר צלב פוגע בגליקוגן התוך-מיופיברילרי (איור 2C).
- הוסף רשת על ידי לחיצה על נתח כלי > > רשת והגדר שטח לנקודה ב- 32,400 ננומטר2. ספרו את מספר הפגיעות ב-12 התמונות המיופיברילריות, כאשר צלב פוגע בגליקוגן הבין-מיופיברילרי (איור 2D).
- באמצעות הכלי קו ישר, מדדו את הקוטר של חמישה חלקיקי גליקוגן שנבחרו באופן אקראי בכל בריכה עבור כל אחת מ-12 התמונות כדי לקבל ממוצע של 60 חלקיקים לכל בריכה לסיב.
הערה: הממוצע של 60 חלקיקים מכסה במידה רבה את השונות בתוך הסיב (איור 2F).
