כימות היווצרות קפלים ממברניים באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סורק

Abstract

מקור: Ahn, W. et al., Visualizing Membrane Ruffle Formation using Scanning Electron Microscopy.J. Vis. Exp. (2021)

סרטון זה מדגים הכנת דגימה, קיבוע והדמיה של תא מקרופאג המציג קפלים של ממברנות באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סורק, SEM. מידע מפורט על מורפולוגיה וארגון של הממברנה חיוני להבנת המצב הפיזיולוגי של התאים.

Protocol

1. קו תאים ותרבית תאים

1. לגדל RAW 264.7 מקרופאגים במדיום הנשר המעובד (DMEM) של Dulbecco בתוספת 10% (vol/vol) סרום בקר עוברי מומת חום (FBS), 100 IU/mL של פניצילין ו-100 מיקרוגרם/מ"ל סטרפטומיצין באינקובטור לח ב-37°C ו-5% CO₂. החליפו את מצעי הצמיחה אחת ליומיים.
2. כאשר התאים הופכים ל-80% נפגשים, שטפו את הצלחת פעמיים באמצעות PBS סטרילי.
3. יש לנתק תאים על ידי הוספת 1,000 μL של 0.5% טריפסין-EDTA ולדגור על צלחת תרבית התאים למשך 3-5 דקות באינקובטור לח בטמפרטורה של 37°C.
4. בחן את הצלחת תחת מיקרוסקופ אור כדי לאשר דיסוציאציה של תאים. הוסף 10 מ"ל של מדיה צמיחה המכילה 10% FBS כדי להשבית טריפסין.
5. אסוף את מתלה הת....

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5% טריפסין-EDTA	גיבקו	15400-054
2% גלוטראלדהיד	מדעי מיקרוסקופ אלקטרונים	16320
4% פרפורמאלדהיד	סנטה קרוז ביוטכנולוגיה	281692
5-(N-אתיל-N-איזופרופיל)-אמילוריד	סיגמא מדעי החיים	A3085
טבליות דבק פחמן	מדעי מיקרוסקופ אלקטרונים	77825-09
דימתיל סולפוקסיד	קורנינג	25-950-CQC
מדיום הנשר המותאם של דולבקו	Cytiva מדעי החיים	SH30022.01
פלקון 24-באר תחתית שטוחה שקופה TC מטופלת צלחת תרבית תאים Multiwell	בז	353047
סרום בקר עוברי	תאומים ביו	900-108
חממת HERAcell 150i CO2	תרמו פישר סיינטיפיק	51026282
האמר דגם 6.2 מעיל Sputter	Anatech, ארצות הברית	58565
מיקרוסקופ אלקטרונים סורק JSM-IT500HR
זכוכית כיסוי למיקרוסקופ	תרמו פישר סיינטיפיק	12-545-82
Pen Strep	גיבקו	15140-122
פורבול 12-מיריסטט 13-אצטט	מיליפור סיגמא	524400
RAW 264.7 מקרופאגים	ATCC	ATCC TIB-71
M-CSF אנושי רקומביננטי	פפרוטק	300-25
מייבש כביסה Samdri-790 Critical Point	חברת המחקר Tousimis	8778ב
תושבות דגימות אלומיניום SEM	מדעי מיקרוסקופ אלקטרונים	75220
נתרן קקודילט	מדעי מיקרוסקופ אלקטרונים	12300
פתרון כחול טריפאן	תרמו פישר סיינטיפיק	15250061