כימות היווצרות קפלים ממברניים באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סורק

תקציר

מקור: Ahn, W. et al., Visualizing Membrane Ruffle Formation using Scanning Electron Microscopy.J. Vis. Exp. (2021)

סרטון זה מדגים הכנת דגימה, קיבוע והדמיה של תא מקרופאג המציג קפלים של ממברנות באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סורק, SEM. מידע מפורט על מורפולוגיה וארגון של הממברנה חיוני להבנת המצב הפיזיולוגי של התאים.

פרוטוקול

1. קו תאים ותרבית תאים

1. לגדל RAW 264.7 מקרופאגים במדיום הנשר המעובד (DMEM) של Dulbecco בתוספת 10% (vol/vol) סרום בקר עוברי מומת חום (FBS), 100 IU/mL של פניצילין ו-100 מיקרוגרם/מ"ל סטרפטומיצין באינקובטור לח ב-37°C ו-5% CO₂. החליפו את מצעי הצמיחה אחת ליומיים.
2. כאשר התאים הופכים ל-80% נפגשים, שטפו את הצלחת פעמיים באמצעות PBS סטרילי.
3. יש לנתק תאים על ידי הוספת 1,000 μL של 0.5% טריפסין-EDTA ולדגור על צלחת תרבית התאים למשך 3-5 דקות באינקובטור לח בטמפרטורה של 37°C.
4. בחן את הצלחת תחת מיקרוסקופ אור כדי לאשר דיסוציאציה של תאים. הוסף 10 מ"ל של מדיה צמיחה המכילה 10% FBS כדי להשבית טריפסין.
5. אסוף את מתלה התא בצינור חרוטי 50 מ"ל וצנטריפוגה ב 400 x גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. השהה מחדש בעדינות תאים בתווך תרבית התאים המלא וקבע את ספירת התאים ואת הכדאיות באמצעות צביעה של Trypan Blue (0.4%) .
   הערה: הכדאיות התאית המינימלית המומלצת לניסוי זה היא >90%.
6. הניחו כיסויי זכוכית סטריליים בבארות של צלחת בת 24 בארות באמצעות מלקחיים אוטוקלאביים. זרעו תאים על גבי כיסויים בצפיפות של 1 x 10⁶ תאים/מ"ל ודגרו על הצלחת למשך הלילה באינקובטור לח בטמפרטורה של 37°C ו-5% CO₂.
7. שנה את המדיה של כל באר עם מדיה מלאה טרייה 500 μL לפני הטיפול. יש לטפל במקרופאגים באמצעות רכב (DMSO או ממסים אחרים המשמשים להמסת EIPA) או מעכב מקרופינוציטוזיס 5-(N-ethyl-N-isopropyl)-Amiloride (EIPA, 25 μM) למשך 30 דקות.
8. לטפל בתאים עם רכב וממריצים של macropinocytosis כדי לקדם קרום ruffling: phorbol 12-myristate 13-אצטט (PMA, 1 μM, 30 דקות) וגורם מגרה מושבת מקרופאגים (M-CSF, 100 ng/mL, 30 דקות).
   הערה: מעכבים חלופיים [למשל, latrunculin A (1 μM, 30 דקות) או cytochalasin D (1 μM, 30 דקות)] וממריצים [למשל, גורם גדילה אפידרמיס (EGF, 100 ng/mL, 10 דקות) או גורם גדילה נגזר טסיות (PDGF, 100 ng/mL, 15 דקות)] של macropinocytosis יכול לשמש גם כדי לאפיין macropinocytosis במקרופאגים וסוגי תאים אחרים. תאים עשויים לדרוש רעב בסרום לילה לפני הטיפול עם ממריצים פיזיולוגיים של macropinocytosis. חשוב לציין כי יהיה צורך לקבוע את הריכוזים וזמני הדגירה היעילים ביותר כדי לעורר מקרופינוציטוזה בסוגי תאים אחרים.

2. קיבוע SEM

1. לאחר הטיפול, שאפו את המדיה מבארות ושטפו את הכיסויים עם PBS קר כקרח פעמיים.
2. תקן תאים (4% paraformaldehyde ו 2% glutaraldehyde ב 0.1 M נתרן cacodylate) במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן דגירה לילה בקיבוע ב 4 ° C.
3. לשטוף בעדינות ולדגור מכסה עם 500 μL של ריאגנטים הבאים מבלי להפריע monolayer התא.
   1. יש לשטוף פעם אחת ב-0.1 מ' נתרן קקודילט ולדגור במשך 15 דקות.
   2. יש לשטוף פעמיים עם dH₂O עם דגירה של 10 דקות בכל כביסה.
   3. יש לשטוף פעמיים עם 25% אתנול עם דגירה של 10 דקות בכל כביסה.
   4. יש לשטוף פעמיים עם אתנול 50% עם דגירה של 10 דקות בכל שטיפה.
   5. יש לשטוף פעמיים עם אתנול 75% עם דגירה של 10 דקות בכל כביסה.
   6. יש לשטוף פעמיים עם 80% אתנול עם דגירה של 10 דקות בכל שטיפה.
   7. יש לשטוף פעמיים עם 95% אתנול עם דגירה של 10 דקות בכל כביסה.
   8. יש לשטוף פעמיים עם 100% אתנול. יש לבצע 10 דקות דגירה בכל כביסה.
      הערה: שינוי/החלפה של ריאגנטים צריך להיעשות מהר כדי למנוע התייבשות אוויר של תאים. ניתן להשאיר את הכיסויים באתנול 100% למשך מספר ימים ב -4 מעלות צלזיוס. לאחסון לטווח ארוך, הוסיפו 100% אתנול נוספים וכסו בארות בפרפילם כדי למנוע התייבשות באוויר של הדגימה.

3. ייבוש נקודה קריטית

1. הכניסו את הכיסויים למייבש כביסה Critical Point וכסו אותם ב-100% אתנול. לחץ על לחצן ההפעלה ופתח את מיכל CO₂.
2. לחצו על כפתור הקירור למשך כ-30 שניות עד שהטמפרטורה תרד ל-0°C. לחצו על כפתור המילוי עד שתופיע בועה בחלון התא.
3. לחץ על כפתור הטיהור עד שריח האתנול מפליטת הטיהור ייעלם. לחצו שוב על כפתור הקירור עד שהטמפרטורה תרד ל-0°C.
4. לחץ על הלחצנים מילוי וניקוי כדי לכבות אותם וסגור את מיכל CO₂. לחצו מחדש על כפתור הקירור כדי לכבות אותו ולחצו על כפתור החום.
5. הגדר את הטמפרטורה על 42 ° C ולחץ על 1,200 psi. לאחר שהלחץ והטמפרטורה מתייצבים, לחץ על לחצן בליד כדי לאפשר ללחץ לרדת באיטיות.
6. ברגע שלחץ התא מגיע ל-150 psi, לחץ על כפתור האוורור והמתן עד שהלחץ יורד ל-0 psi. כבו את מייבש הנקודות הקריטיות והסירו את הכיסויים.
7. הרכבה מכסה על תושבות דגימות אלומיניום SEM באמצעות לשוניות דבק פחמן ובכפוף לציפוי מרזב באמצעות זהב/פלדיום בקואטר מרזב.
8. הפעל את לחצן ההפעלה והמתן עד ששואב האבק יגיע ל -30 mTorr. שטפו את התא כדי להסיר לחות ואוויר על ידי כיבוי מתג הגז וסיבוב שסתום הגז העדין נגד כיוון השעון.
9. ברגע שהוואקום עולה ל 200 mTorr, כבה את מתג הגז והמתן עד שהוואקום יגיע ל 30 mTorr. חזור על שלב זה 3 פעמים.
10. לחץ על כפתור הטיימר וכוונן את ידית המתח עד שהמד יקרא 10 mA. הסירו את הכיסויים המצופים מהתא.
    הערה: עקוב אחר הוראות היצרן כדי לבצע ייבוש נקודתי קריטי וציפוי מרזב של הדגימה.

4. הדמיה וכימות

1. הכנס כיסויי דגימה לתא של מיקרוסקופ אלקטרונים סורק. סגור את הדלת ולחץ על לחצן Evac.
2. פתח את תוכנת הפעולה SEM. הגדר את מתח ההאצה ל -15 קילו וולט ואת מרחק העבודה ל -10 מ"מ.
3. לחצו על כפתור הקואורדינטות והסתובבו בבקר עד שהתאים יופיעו במרכז מסך התצפית. הגדר את ההגדלה ל- 3,500x וצלם את הדגימה על-ידי לחיצה על לחצן תמונה.
   הערה: השתמש ברמה גבוהה יותר של הגדלה (8,500x עד 16,000x) כדי להציג את קרום הפלזמה בפירוט רב יותר.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
0.5% טריפסין-EDTA	גיבקו	15400-054
2% גלוטראלדהיד	מדעי מיקרוסקופ אלקטרונים	16320
4% פרפורמאלדהיד	סנטה קרוז ביוטכנולוגיה	281692
5-(N-אתיל-N-איזופרופיל)-אמילוריד	סיגמא מדעי החיים	A3085
טבליות דבק פחמן	מדעי מיקרוסקופ אלקטרונים	77825-09
דימתיל סולפוקסיד	קורנינג	25-950-CQC
מדיום הנשר המותאם של דולבקו	Cytiva מדעי החיים	SH30022.01
פלקון 24-באר תחתית שטוחה שקופה TC מטופלת צלחת תרבית תאים Multiwell	בז	353047
סרום בקר עוברי	תאומים ביו	900-108
חממת HERAcell 150i CO2	תרמו פישר סיינטיפיק	51026282
האמר דגם 6.2 מעיל Sputter	Anatech, ארצות הברית	58565
מיקרוסקופ אלקטרונים סורק JSM-IT500HR
זכוכית כיסוי למיקרוסקופ	תרמו פישר סיינטיפיק	12-545-82
Pen Strep	גיבקו	15140-122
פורבול 12-מיריסטט 13-אצטט	מיליפור סיגמא	524400
RAW 264.7 מקרופאגים	ATCC	ATCC TIB-71
M-CSF אנושי רקומביננטי	פפרוטק	300-25
מייבש כביסה Samdri-790 Critical Point	חברת המחקר Tousimis	8778ב
תושבות דגימות אלומיניום SEM	מדעי מיקרוסקופ אלקטרונים	75220
נתרן קקודילט	מדעי מיקרוסקופ אלקטרונים	12300
פתרון כחול טריפאן	תרמו פישר סיינטיפיק	15250061