מיקרוסקופ פלואורסצנטי תוך חיוני לחקר היווצרות פקקת מיקרו-וסקולרית

כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.

1. סידור מראש של בעלי החיים

1. שקול עכבר וטען את התרופה המתאימה (למשל, הקנבינואידים, 5 מ"ג / ק"ג משקל גוף (bw)) לתוך מזרק אינסולין. לנהל את התרופה 30 דקות לפני השראת פקקת.
2. על ידי החזקת צוואר העכבר בין האגודל לבין האצבע המורה ואת זנב העכבר עם האצבע הקטנה, למתוח את החיה ולהזריק את התרופה intraperitoneally (ip) לתוך הרביע השמאלי התחתון של הבטן. החזירו את בעל החיים לכלוב למשך 15 דקות.
3. הכינו הרדמה עם קטמין (90 מ"ג/ק"ג כ"ס) וקסילזין (25 מ"ג/ק"ג כ"ס). 15 דקות לפני השראת פקקת, מרדימים את העכבר. הכניסו את העכבר לכלוב, משכו מעט את הזנב והזריקו את חומר ההרדמה עם מזרק אינסולין.
4. החזירו את העכבר לכלוב עד תחילת ההרדמה. כדי לוודא הרדמה מספקת, צבטו את הזנב במלקחיים.
5. יש להעמיס 0.05 מ"ל של דקסטרן מופשר עם תווית איזותיוציאנט (FITC-dextran; 5%, 150 kDa) לתוך מזרק אינסולין. בעת מילוי המזרק, ודא שלא נותרו בועות אוויר, מכיוון שאפילו בועות אוויר קטנות הניתנות תוך ורידי (iv) יכולות להיות קטלניות עבור החיה.
6. הניחו את העכבר המורדם על פלטת חימום במצב עם הפנים כלפי מטה. כוונן את צלחת החימום ל 37 ° C.
7. שים משחת עיניים על הקרנית של העכבר. לחטא את העור ולהשתמש במכשירים סטריליים.
8. תפרו שני תפרים של פוליפרופילן 7/0 לקצה הגולגולתי והקאודלי של אוזן ימין. הניחו את התפרים קרוב ככל האפשר לקצה וקרוב ככל האפשר לבסיס (איור 1B).
9. העבר את העכבר למצב גבי. מקבעים את כל הרגליים למשטח זכוכית אקריל באמצעות פסי הדבקה. חברו תפר מתחת לשיניים הקדמיות ומקמו את הראש בדורסיפלקסיה על ידי הדבקת התפר לזכוכית האקריל עם רצועות הדבקה.
10. העבר את החיה על הפלטפורמה תחת הסטריאומיקרוסקופ המבצע. יש להשתמש בהגדלה של פי 16.

2. הכנת וריד הצוואר השמאלי והזרקת FITC-Dextran

הערה: למיקרוסקופ של אוזן ימין, הכינו את וריד הצוואר השמאלי.

1. בעזרת אזמל יוצרים חתך של 5 מ"מ בעור בצד שמאל של הצוואר בכיוון גולגולתי. לנתח את הרקמה תת עורית עם microglycps ו microscissors. או לקשור כלי מעבר עם תפרים פוליאסטר 8/0 או עם electrocoagulation.
2. שחררו את הווריד מהאדנטיציה שלו באמצעות מיקרו מלקחיים ומיקרומספריים מבלי לגעת בכלי השיט.
3. השתמש מזרק אינסולין מוכן להזרקת צבע פלואורסצנטי. בזהירות לתפוס את קיר הכלי עם microלקחיים, מבלי לנקב את הווריד. לחדור את דופן הכלי המרוחק עם המזרק ולהזריק FITC-dextran iv.
4. עצור את הדימום לאחר משיכת המזרק באמצעות צמר גפן. הימנע זיהום דם וצבע של האוזן.

3. מיקום אוזן ימין למיקרוסקופ פלואורסצנטי תוך חיוני

1. מעבירים את בעל החיים על פלטת החימום לקונסטרוקציית זכוכית אקריל עם חריץ לפלטת החימום ומישור בגובה 0.5 ס"מ למיקום האוזן.
2. תקן את בעל החיים עם הפנים כלפי מטה על צלחת החימום באמצעות רצועות דבק. הניחו את הסחוס החזק והקמור יחסית בבסיס האוזן לצד המישורים בגובה 0.5 ס"מ עבור האוזן (איור 1B), כך שניתן יהיה למקם את החלק האפי של האוזן שטוח על המישור.
3. הוסיפו טיפה אחת של 0.9% NaCl בטמפרטורת החדר למישור זכוכית האקריל על מנת למקם את האוזן. מניחים את אוזן ימין, כאשר התפרים שנקבעו מראש בצד הגחוני הקעור שלה פונים כלפי מטה, על ירידה של 0.9% NaCl. בעזרת מקלוני צמר גפן, סופגים את טיפת NaCl ונותנים לכוחות נימיים לחבר את מישור האוזן לזכוכית האקריל.
4. הדביקו את התפרים לזכוכית האקריל כדי לקבע את מיקום האוזן.
5. הוסף טיפה אחת של 0.9% טמפרטורת החדר NaCl לצד הגבי הקמור של האוזן. יש להניח בזהירות כיסוי אחד (בקוטר 0.5 ס"מ) על האוזן מבלי לדחוס את כלי הבסיס הנכנסים לאוזן. בעזרת מקלוני צמר גפן, הסירו כמה שיותר NaCl מתחת למכסה על מנת למזער את המרחק בין הכיסוי לכלי המטרה של האוזן.

4. מיקרוסקופ פלואורסצנטי תוך חיוני והשראת פקקת של אוזן ימין

1. התאם את המיקרוסקופ הפלואורסצנטי התוך חיוני להדמיית FITC-dextran (450 - 490 ננומטר; רגל: 510; ל"פ: 520). השתמש במנורת כספית משתנה של 100 ואט כמקור אור. חבר מצלמת CCD שחור-לבן ברזולוציה גבוהה לצריב DVD.
2. העבירו את בעל החיים על זכוכית אקריל המכילה את פלטת החימום עם האוזן החטופה הקבועה לשולחן המיקרוסקופ הפלואורסצנטי התוך חיוני.
3. באמצעות הגדלה של 20X (צמצם מספרי של 20X/0.95) ועוצמת אור של 20%, חפש כלי דם ורידי בקוטר 50 - 60 מיקרומטר ועם זרימת דם אנטרוגרדית של 400 - 600 מיקרומטר לשנייה.
4. יש להוסיף טיפה אחת של מים בטמפרטורת החדר למכסה לטבילה במים של יעד ההגדלה פי 63 (צמצם מספרי של 63X/0.95). השתמש מזרק עם צינורית בקוטר 1 מ"מ ומניחים את הטיפה על המטרה של המיקרוסקופ. הוסיפו מספיק מים כדי ליצור קשר עם הכיסוי והמטרה עם טיפת המים.
5. מיד לאחר היישום של טיפת המים, להתחיל להקליט את הכלי במשך 20 s עם עוצמת אור 20% למדידה לא מקוונת של הקוטר ואת זרימת הדם.
6. התחל אינדוקציה פקקת 5 דקות לאחר הזרקת FITC-dextran. לשם כך, העלה את עוצמת האור ל -100%.
7. במהלך השראת פקקת, סגור את הצמצם של המיקרוסקופ למשך 2 שניות בפרק זמן של 30 שניות כדי לבדוק את זרימת הדם. במקרה של זרימת דם מתמשכת, פתח שוב את הצמצם. במקרה של זרימת דם מופסקת, לבחון את כלי הדם במשך 30 s.
   הערה: כלי הדם מסווג כמוסתר אם הזרימה עומדת ללא תזוזה במשך 30 שניות או יותר או אם הדם זורם בנסיגה. אם זרימת הדם האורתוגרדית מתחילה שוב, פתח לחלוטין את הצמצם והמשך בהשראת פקקת עד להתרחשות חסימת כלי הדם כמתואר לעיל. במהלך השראת פקקת מוקדמת, יש לוודא כי הזמנים בהם נסגר הצמצם לבדיקת זרימת הדם קצרים ככל האפשר על מנת לשמור על אפי-הארה כמעט רציפה. מאוחר יותר, במהלך צמיחת פקקת, הכלי הוא מחורר עם צבע פלואורסצנטי פחות, כך שניתן לראות ברציפות.
8. בחר והסתיר 5 כלי דם לכל אוזן. הגבל את זמן השראת פקקת תחת המיקרוסקופ לכשעה לאחר ההזרקה של FITC-dextran.

איור 1. הכנת הווריד הצווארי (A) ומיקום האוזן למיקרוסקופ תוך חיוני (B). (A) באמצעות הניתוח סטריאוסקופ מכינים את וריד הצוואר הימני. התפרים למיקום האוזן השמאלית נתפרים לפני הזרקת FITC-dextran. הפצע מהדיסקציה הקודמת של וריד הצוואר השמאלי נסגר בתפרים טרנסעוריים (B). האוזן השמאלית קבועה בתפרים מפוליפרופילן 7/0. כיסוי ממוקם בזהירות מבלי לדחוס את כלי הבסיס של האוזן. פלטת חימום שומרת על טמפרטורת הגוף של החיה במהלך כל הניסוי.