ספקטרוסקופיית תהודה מגנטית גרעינית לזיהוי זרחונים מרובים בחלבונים

תקציר

מקור: Danis, C. et. al., ספקטרוסקופיית תהודה מגנטית גרעינית לזיהוי זרחן מרובה של חלבונים לא מסודרים במהותם.J. Vis. Exp.(2016).

סרטון זה מדגים את השימוש בטכניקות ספקטרוסקופיית תהודה מגנטית גרעינית (NMR) כדי לזהות זרחונים מרובים בחלבון. הזרחן של חלבון בחומצת אמינו ספציפית גורם להסרת ההגנה של מימן אמיד השכן, אשר יוצר את ההבדל הספקטרלי.

פרוטוקול

1. ייצור של ¹⁵N, ¹³C-Tau (איור 1)

1. ATransform pET15b-Tau רקומביננטי T7 ביטוי פלסמיד לתוך BL21(DE3) מוסמכים Escherichia coli חיידקים תאים.
   הערה: קידוד cDNA עבור איזופורם טאו הארוך ביותר (441 שאריות חומצות אמינו) משובט בין אתרי הגבלה NcoI ו- XhoI בפלסמיד pET15b.
   1. מערבבים בעדינות 50 μl של תאי BL21(DE3) מוכשרים, ויוצרים 1-5 x 10⁷ מושבות לכל מק"ג של DNA פלסמיד, עם 100 ng של DNA פלסמיד בצינור פלסטיק של 1.5 מ"ל.
      הערה: זני חיידקים אופטימליים לשימוש בקודון לביטוי cDNA אאוקריוטי אינם חיוניים לייצור טאו אנושי.
   2. הניחו את תערובת התאים על קרח למשך 30 דקות ולאחר מכן חממו בחום למשך 10 שניות בטמפרטורה של 42°C. הניחו את הצינור בחזרה על הקרח למשך 5 דקות והוסיפו 1 מ"ל של LB (Luria-Bertani) בינוני בטמפרטורת החדר. יש לדגור על התרחיף החיידקי בטמפרטורה של 37°C למשך 30 דקות תחת תסיסה עדינה.
2. יש למרוח באמצעות לולאת חיסון 100 מיקרוליטר של תרחיף תאים באופן שווה על צלחת אגר של מדיום LB המכיל 100 מיקרוגרם / מ"ל של אנטיביוטיקה אמפיצילין.
3. לדגור על צלחת הבחירה במשך 15 שעות ב 37 ° C.
4. שמור את צלחת הבחירה על 4 ° C עד שתמשיך לשלב התרבית, למשך מקסימום של שבועיים בערך.
   הערה: מלאי גליצרול של תרבית חיידקים (50% גליצרול), המאוחסן ב -80 ° C, יכול להיות מוכן להתחיל את התרבית בשלב מאוחר יותר.
5. הוסף 1 מ"ל 1 M MgSO₄, 1 מ"ל 100 mM CaCl₂, 10 מ"ל 100x MEM ויטמין משלים, 1 מ"ל 100 מ"ג / מ"ל אמפיצילין ל 1 ליטר מלחי M9 autoclaved (6 גרם Na₂HPO₄, 3 גרם KH₂PO₄, 0.5 גרם NaCl).
   הערה: משקע לבן ייווצר עם הוספת תמיסת CaCl₂ למלחי M9 המתפוגגת במהירות.
6. מסיס 300 מ"ג של ¹⁵N, ¹³C-Complete בינוני, 1 גרם של ¹⁵NH₄Cl, ו 2 גרם של ¹³C_{6-גלוקוז} ב 10 מ"ל של M9 בינוני. סנן-עיקור תמיסת האיזוטופ באמצעות מסנן 0.2 מיקרומטר, ישירות לתוך תווך M9.
7. השהיה באמצעות לולאת חיסון, מושבה אחת של pET15b-Tau הפכה חיידקים מצלחת הבחירה ב 20 מ"ל של LB בינוני בתוספת 100 מיקרוגרם / מ"ל של אמפיצילין.
8. לדגור על התווך המחוסן ב 37 ° C במשך כ 6 שעות.
9. מדידת צפיפות אופטית ב- 600 ננומטר (OD₆₀₀) על 1 מ"ל של דילול פי עשרה של תרבית חיידקים בקובט ספקטרומטר פלסטי.
   הערה: עכירות של תרבית החיידקים המתאימה OD₆₀₀ של 3.0-4.0 מציין כי שלב צמיחת הרוויה הוא הגיע.
10. יש להוסיף 20 מ"ל של תרבית LB רוויה ל-1 ליטר של מדיום גידול M9 בתוספת אמפיצילין (ריכוז סופי של 100 מק"ג/מ"ל), בבקבוק תרבית פלסטיק מבולבל של Erlenmeyer בנפח 2 ליטר.
11. מניחים את בקבוק התרבית באינקובטור הניתן לתכנות המוגדר ל -10 מעלות צלזיוס ו -50 סל"ד. תכננו את האינקובטור לעבור ל-200 סל"ד ו-37 מעלות צלזיוס בשעות הבוקר המוקדמות של היום שלמחרת.
12. יש למדוד OD₆₀₀ על 1 מ"ל של תרבית חיידקים בקובט ספקטרומטר פלסטי. הוסף 400 μl של 1 M IPTG (isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside) תמיסת מלאי (נשמר ב -20 ° C) כאשר OD₆₀₀ מגיע לערך של כ 1.0 כדי לגרום לביטוי של חלבון טאו רקומביננטי.
13. המשך את הדגירה ב 37 ° C במשך 3 שעות נוספות. לאסוף את תאי החיידקים על ידי צנטריפוגה ב 5,000 x גרם במשך 20 דקות.
14. יש להקפיא את כדורית החיידקים בטמפרטורה של -20°C. לשמור בהקפאה עד לשלב הטיהור, לתקופה ממושכת במידת הצורך.

2. טיהור של ¹⁵N, ¹³C-Tau (איור 2)

1. מאגרי טיהור Autoclave cation-exchange (CEX) ב-121°C מתחת ל-15 psi למשך 20 דקות. יש לאחסן את המאגרים ב-4°C.
2. הפשירו את כדורית תא החיידק והשהו מחדש ביסודיות ב-45 מ"ל מיצוי מאגר CEX A (50 mM NaPi buffer pH 6.5, 1 mM EDTA) בתוספת קוקטייל מעכב פרוטאז 1x (טבליה אחת) ו-DNAseI (2,000 יחידות).
3. לשבש את תאי החיידק באמצעות הומוגנייזר בלחץ גבוה ב 20,000 psi. 3-4 מעברים נחוצים. צנטריפוגה במהירות 20,000 x גרם למשך 40 דקות להסרת חומר בלתי מסיס.
4. חממו את תמצית תאי החיידק במשך 15 דקות בטמפרטורה של 75°C באמצעות אמבט מים.
   הערה: משקע לבן נצפה לאחר מספר דקות.
5. צנטריפוגה של 15,000 x גרם למשך 20 דקות ולשמור על הסופרנאטנט המכיל את חלבון הטאו היציב בחום.
6. יש לאחסן בטמפרטורה של -20°C עד לשלב הטיהור הבא, במידת הצורך.
7. בצעו כרומטוגרפיה של החלפת קטיונים על שרף CEX חזק ארוז כעמודת מיטה של 5 מ"ל באמצעות מערכת כרומטוגרפיה נוזלית חלבונית מהירה (FPLC) (איור 3 A).
   1. הגדר את קצב הזרימה ל- 2.5 מ"ל/דקה.
   2. איזון העמודה במאגר CEX A
   3. העמיסו את התמצית המחוממת 60-70 מ"ל המכילה טאו באמצעות משאבה לדוגמה, או לחילופין משאבה A, בהתאם למערכת. אסוף את הזרימה לניתוח כדי לוודא שחלבון טאו נקשר ביעילות לשרף (ראה 2.8).
   4. שטפו את השרף עם חיץ CEX A עד שהספיגה ב-280 ננומטר תחזור לערך הבסיסי.
   5. Elute Tau מהעמודה באמצעות שיפוע NaCl תלת שלבי המתקבל על ידי הגדלה הדרגתית של מאגר CEX B (מאגר CEX A עם 1 M NaCl). תכנת את ה- FPLC באופן הבא: השלב הראשון של השיפוע למאגר CEX B של 25% בכרכים של 10 עמודות (CV) כדי להגיע ל- 250 mM NaCl, השלב השני למאגר CEX B של 50% ב- 5 CV כדי להגיע ל- 500 mM NaCl, והשלב השלישי למאגר CEX B של 100% ב- 2 CV כדי להגיע ל- 1 M NaCl. לאסוף 1.5 מ"ל שברים במהלך שלבי elution.
8. נתחו 10 μl מהשברים שנאספו במהלך שלב ה-elution על-ידי SDS-PAGE (12% ג'ל SDS-אקרילאמיד) וצביעת קומאסי (איור 3 A). בדוק גם את שלב הטעינה על העמוד על ידי ניתוח 10 μl של הזרימה.
9. בחר את השברים המכילים Tau ואסוף שברים אלה לשלב הבא.
10. בצעו חילופי חיץ על שברים מאוגמים המכילים טאו (איור 3 B).
    1. איזון עמודת התפלה של 53 מ"ל G25 ארוז שרף מיטה (26 x 10 ס"מ) ב 50 mM אמוניום ביקרבונט (חיץ נדיף) באמצעות מערכת FPLC.
    2. כוונו את קצב הזרימה ל-5 מ"ל/דקה. הזריקו את דגימת הטאו על העמוד דרך לולאת הזרקה של 5 מ"ל. לאסוף שברים המתאימים לשיא הספיגה ב 280 ננומטר.
    3. חזור על ההזרקה 3-4 פעמים, בהתאם לנפח מאגר CEX הראשוני.
11. חשב את כמות חלבון טאו מטוהר באמצעות אזור השיא של הכרומטוגרמה ב 280 ננומטר (1 מ"ג של טאו מתאים ל 140 mAU * ml).
    הערה: מקדם ההכחדה של חלבון טאו ב-280 ננומטר הוא 7,550 ^{M-1 cm-1}. Tau אינו מכיל שאריות TRP.
12. אגרף את כל שברי טאו.
13. Aliquot את הדגימה לתוך צינורות המכילים את המקבילה של 1 עד 5 מ"ג של טאו. בחר צינורות אלה כך נפח התמיסה קטן לעומת נפח הצינור (למשל 5 מ"ל של תמיסה בצינור 50 מ"ל).
14. ניקוב חורים במכסי הצינור באמצעות מחט. יש להקפיא דגימות טאו בטמפרטורה של -80°C.
15. Lyophilize דגימות טאו. חלבון טאו Lyophilized יכול להישמר ב -20 ° C לפרקי זמן ארוכים.

3. זרחן חוץ גופי של ¹⁵N-Tau

1. להמיס 5 מ"ג של טאו lyophilized ב 500 μl phosphorylation buffer (50 mM Hepes·KOH, pH 8.0, 12.5 mM MgCl₂, 1 mM EDTA, 50 mM NaCl).
2. הוסף 2.5 mM ATP (25 μl של 100 mM תמיסת מלאי נשמר ב -20 ° C), 1 mM DTT (1 μl של 1 M תמיסת מלאי נשמר ב -20 ° C), 1 mM EGTA (2 μl של תמיסת מלאי 0.5 M), 1x קוקטייל מעכב פרוטאז (25 μl של ציר 40x המתקבל על ידי המסת 1 טבליה ב 1 מ"ל חיץ זרחן) ו 1 μM מופעל His-ERK2 (250 μl במאגר שימור 10 mM Hepes, pH 7.3, 1 mM DTT, 5 mM MgCl₂, 100 mM NaCl ו-10% גליצרול, מאוחסן ב-80°C-) בנפח דגימה כולל של 1 ml.
   הערה: ניתן להכין את His-ERK2 המופעל בבית על ידי זרחן עם MEK kinase.
3. לדגור 3 שעות ב 37 °C.
4. חממו את הדגימה בטמפרטורה של 75°C למשך 15 דקות כדי להשבית את ERK kinase.
5. צנטריפוגה ב 20,000 x גרם במשך 15 דקות. לאסוף ולשמור את supernatant.
6. התפלת דגימת החלבון לתוך 50 mM אמוניום ביקרבונט באמצעות עמוד של 3.45 מ"ל G25 ארוז שרף (1.3 x 2.6 ס"מ), אשר מתאים דגימה 1 מ"ל.
7. הריצו 12% SDS-PAGE עם 2.5 μl של דגימת החלבון כדי לבדוק גם את שלמותה וגם את הזרחן היעיל שלה (איור 4).
8. Lyophilize דגימת טאו phosphorylated. יש לאחסן את האבקה בטמפרטורה של -20°C.

4. רכישת NMR Spectra (איור 5)

1. מסיס 4 מ"ג של lyophilized ¹⁵N, ¹³C ERK-phosphorylated-Tau ב 400 μl NMR buffer (50 mM NaPi או 50 mM deuterated Tris-d11. Cl, pH 6.5, 30 mM NaCl, 2.5 mM EDTA ו- 1 mM DTT).
2. הוסף 5% D₂O לנעילת שדה של ספקטרומטר NMR ו- 1 mM TMSP (3-(trimethylsilyl)propionic-2,2,3,3-d₄ מלח נתרן חומצי)) כייחוס אות NMR פנימי. הוסף 10 μl של תמיסת מלאי 40x של קוקטייל מעכב פרוטאז מלא.
3. מעבירים את הדגימה לצינור NMR בקוטר 5 מ"מ באמצעות מזרק אלקטרוני עם מחט ארוכה או פיפטה של פסטר. סגור את צינור ה- NMR באמצעות הבוכנה. הסר את כל בועות האוויר הכלואות בין הבוכנה לנוזל על ידי תנועות הבוכנה.
4. הניחו את צינור ה-NMR בספינר. התאם את מיקומו האנכי בספינר עם המד המתאים לראש הבדיקה NMR בשימוש, כך שרוב תמיסת הדגימה תהיה בתוך סליל NMR.
5. התחלת זרימת האוויר: לחץ/י על ״הרם״ בחלון מערכת בקרת המגנטים. מניחים בזהירות את הספינר עם הצינור בזרימת האוויר בחלק העליון של משעמם המגנט. עצור את זרימת האוויר (לחץ על הרם) ותן לצינור לרדת למקומו בתוך ראש הגשושית במגנט.
6. הגדר את הטמפרטורה ל 25 ° C (298 K).
7. בצע כוונון והתאמה חצי אוטומטיים של ראש הבדיקה כדי למטב את העברת הכוח. הקלד atmm בשורת הפקודה.
8. נעל את תדר הספקטרומטר באמצעות אות D₂O של הדגימה שנרשמה בערוץ הדאוטריום. לחץ על נעל בחלון מערכת בקרת המגנט.
9. התחל את הליך השיימינג כדי לייעל את ההומוגניות של השדה המגנטי במיקום הדגימה. הקלד topshim gui בשורת הפקודה כדי לפתוח את חלון shim. לחץ על התחל בחלון shim. בדוק את ערך הווריאציה הסטנדרטית השיורית B0 כדי לוודא ש- shims הם אופטימליים (פחות מ- 2 הרץ זה טוב).
10. כיול פרמטר p1 (אורך פולס גלי רדיו של פרוטון במיקרו-סקה), הדרוש לקבלת סיבוב של 90° של סיבובי פרוטון. כוונו לפולס של 360° באמצעות ספקטרום 1D של פרוטוני מים (איור 6).
11. התאימו את היסט התדרים על-ידי הגדרת הפרמטר o1 (בהרץ) לתדר מי הפרוטון בספקטרום 1D (איור 6).
12. התחל לרכוש ספקטרום פרוטונים 1D (רצף פולסים עם רצף שער מים לדיכוי אותות מים, לדוגמה, zggpw5) כדי לאמת אותות מהדגימה (איור 7). התאימו את מספר הסריקות לריכוז החלבון היחסי. הקלד zg בשורת הפקודה כדי להתחיל את הרכישה.

תוצאות

איור 1: סכמה של השלבים העיקריים של ייצור חלבונים רקומביננטיים ותיוג איזוטופי. השלבים מטרנספורמציה של חיידקים לייצור חלבון רקומביננטי מתוארים כמתואר בפסקה 1 של הפרוטוקול.

איור 2: סכימת השלבים העיקריים של טיהור חלבון טאו רקומביננטי. השלבים מליזה של תאי ח...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
pET15B ביטוי רקומביננטי T7 פלסמיד	Novagen	69257	שמור ב-20° C
BL21 (DE3) חיידקי E.coli מוכשרים לטרנספורמציה	ניו אינגלנד Biolabs	C2527I	שמור על -80 & # 176; C
מרק LB אוטוקלב, Lennox	DIFCO	240210	גידול חיידקים בינוני
MEM ויטמין משלים 100X	Sigma	58970C	תוסף תזונה בינוני לצמיחת חיידקים
15N, 13C-ISOGRO אבקה בינונית שלמה	Sigma	608297	תוסף גידול חיידקים בינוני
15NH4Cl	Sigma	איזוטופ	299251 Isotope
13C-Glucose	Sigma	389374	איזוטופ יש לשמור על 4°
טבליות מעכב פרוטאז	Roche	5056489001	טבליה אחת ב-1 מ"ל היא תמיסה פי 40 שניתן לשמור ב-20° C
DNaseI	EUROMEDEX	1307	שמור על -20° C
הומוגנייזר (EmulsiFlex-C3)	AVESTIN		Lysis מתממש ב-4° C
PierceTM סמן חלבון MW לא מוכתם פירס		266109
קינאז MEK1 אנושי פעיל	Sigma	M8822	שמור ב -80° C
AKTÄ מערכת כרומטוגרפיה טהורה	GE Healthcare		FPLC
HiTrap SP Sepharose FF (עמודה של 5 מ"ל)	GE Healthcare	17-5156-01	עמודות כרומטוגרפיה להחלפת קטיון
HiPrep 26/10 התפלת	GE Healthcare	17-5087-01	עמודת התפלת חלבון
PD MidiTrap G-25	GE Healthcare	28-9180-08	עמודת התפלת חלבון
Tris D11, 97% D	Cortecnet	CD4035P5	Deuterated NMR buffer
5 מ"מ מיקרו-צינור סימטרי SHIGEMI D2O (סט של 5 פנימי & צינור חיצוני)	Euriso-top	BMS-005B	NMR Shigemi Tubes
eVol kit-אלקטרוני מזרק מתנע ערכת	Cortecnet	2910000	Pipetting
Bruker 900MHz AvanceIII עם תהודה משולשת בדיקה קריוגנית	Bruker		NMR ספקטרומטר לרכישת נתונים
Bruker 600MHz DMX600 עם בדיקה קריוגנית תהודה משולשת	Bruker		NMR ספקטרומטר לרכישת נתונים