טכניקת ספקטרוסקופיית הדיכרואיזם המעגלי לחקר אינטראקציות DNA-חלבון

תקציר

מקור: Arya, V., et al. CD ספקטרוסקופיה לחקר אינטראקציות DNA-חלבון. J. Vis. Exp. (2022).

סרטון זה מדגים את טכניקת ספקטרוסקופיית הדיכרואיזם המעגלי (CD) לחקר שינויים קונפורמטיביים המתרחשים בדנ"א בנוכחות חלבון עיצוב מחדש של כרומטין תלוי ATP. השינויים בספקטרום ה-CD שנמדדו בנוכחות ובהיעדר הידרוליזה של ATP מצביעים על חשיבותו של ATP ביכולתו של המשפץ לגרום לשינויים קונפורמטיביים בדנ"א הכבול.

פרוטוקול

1. ריכוז עבודה של מרכיבי התגובה

1. הכינו את ריכוזי העבודה של המאגרים לתקליטור טרי ושמרו אותם בטמפרטורה של 4°C לפני הגדרת התגובות.
   הערה: עבור תגובות CD המתוארות במאמר זה, ריכוזי העבודה של רכיבים הם כדלקמן: מאגר נתרן פוספט (pH 7.0) 1 mM, ATP 2 mM, DNA 500 nM, חלבון 1 μM, MgCl₂ 10 mM, EDTA 50 mM, ADAADiN 5 μM.

2. בחירה והכנה של קוביות CD

1. אסוף ספקטרום תקליטורים בקובטות קוורץ בעלות שקיפות גבוהה. השתמש בקוביות מלבניות או גליליות.
   הערה: קובטת קוורץ CD (נפח נומינלי של 0.4 מ"ל, אורך נתיב של 1 מ"מ) שימשה לכל התגובות המתוארות במאמר זה.
2. השתמש בתמיסת ניקוי קובטה כדי לנקות את הקובט. הוסיפו תמיסת ניקוי קובטה 1% במים כדי ליצור 400 מיקרוליטר של התמיסה, שפכו אותה לקובט ודגרו עליה בטמפרטורה של 37°C למשך שעה אחת.
3. לשטוף את cuvette עם מים מספר פעמים כדי לנקות את cuvette. בצע סריקה של המים או החיץ בקובט כדי לבדוק אם הם נקיים.
   הערה: המים או החיץ חייבים לתת קריאה בטווח 0 עד 1 mdeg.

3. הכנת חלבונים ואוליגונוקלאוטיד DNA

1. שמור על נפח החלבון מתחת ל -50 μL בתגובה כדי למזער את כמויות רכיבי החיץ שלפעמים גורמים להיווצרות פסגות מעורפלות. שמור את החלבון על הקרח לאורך כל הניסוי כדי למנוע כל התפרקות.
2. השתמש באוליגונוקלאוטידים של DNA מטוהרים בדף בתגובות.
   הערה: בתגובות המתוארות כאן, דנ"א שימש הן בצורות מקוריות והן בצורות מקוררות חום (מקורר מהיר (FC) ומקורר לאט (SC)). קירור מהיר מקדם קשר תוך-מולקולרי בדנ"א, ומניב מבנים משניים נוספים. לעומת זאת, קירור איטי מקדם קשרים בין-מולקולריים בדנ"א, וכתוצאה מכך פחות מבנים משניים.
3. לקירור מהיר, חממו DNA ב-94°C למשך 3 דקות על בלוק החימום וקררו אותו מיד על קרח. לקירור איטי, חממו את הדנ"א ב-94°C למשך 3 דקות ואפשרו לו להתקרר לטמפרטורת החדר בקצב של 1°C לדקה.

4. הגדרת ניסויי בקרה להקלטת הספקטרום הבסיסי

1. שמור על נפח התגובה על 300 μL בכל התגובות. הגדר סך של 5 תגובות בסיסיות בצינורות צנטריפוגות 1.5 מ"ל, בזו אחר זו, כדלקמן: i) חיץ + מים; ii) חיץ + MgCl₂ + ATP + מים; iii) מאגר + MgCl₂ + ATP + חלבון + מים; iv) iii + EDTA או ADAADiN; v) חיץ + חלבון + מים.

5. הגדרת הניסויים להקלטת ספקטרום תקליטורים

1. הגדר סך של 5 תגובות, אחת אחת, בצינורות צנטריפוגות 1.5 מ"ל כדלקמן: i) חיץ + DNA + מים; ii) חיץ + DNA + MgCl₂ + ATP + מים; iii) מאגר + DNA + MgCl₂ + ATP + חלבון + מים; iv) iii + EDTA או ADAADiN; v) חיץ + DNA + חלבון + מים.

6. סריקת הקלטה

1. הפעל את הגז והפעל את ספקטרומטר התקליטורים.
2. הפעל את המנורה לאחר 10-15 דקות. הפעל את אמבט המים והגדר את טמפרטורת המחזיק על 37 מעלות צלזיוס.
3. פתח את תוכנת ספקטרום התקליטורים.
   1. הגדר את הטמפרטורה ל 37 °C (77 °F).
   2. הגדר את טווח אורכי הגל על 180 - 300 ננומטר.
   3. הגדר את הזמן לנקודה ל- 0.5 שניות.
   4. הגדר את מספר הסריקה ל- 5.
   5. לחץ על Pro-Data Viewer, צור קובץ חדש ושנה את שמו עם פרטים על הניסוי והתאריך.
4. שמור את כל רכיבי התגובה על קרח כדי למנוע כל התפרקות. הכינו את קווי הבסיס והתגובות, בזה אחר זה, בצינורות צנטריפוגות וערבבו אותם על ידי פיפטציה. העבירו את תערובת התגובה לקובט בזהירות, וודאו שאין בועות אוויר.
5. אם אתם מבצעים ניסוי במסלול זמן, דגרו על התגובות בטמפרטורה של 37°C למשך הזמן הנדרש ובצעו את הסריקה. הוסיפו EDTA למאגר המכיל את הדנ"א, ATP, Mg⁺² והחלבון כדי לעצור הידרוליזה של ATP.
6. הגדל את ריכוז ה- EDTA ואת זמן הדגירה שלו כדי לעכב את פעילות ATPase לחלוטין.
7. החסר את קווי הבסיס מהתגובות המתאימות בתוכנה (לדוגמה, החסר את תגובה 1 מקו הבסיס 1). החלק את הנתונים בתוכנת ספקטרום התקליטורים או בתוכנת התוויית הנתונים. התווה את הנתונים בתוכנת התוויית הנתונים.
   הערה: חיסור קווי הבסיס מהתגובות המתאימות ייתן ספקטרום CD נטו של דנ"א בלבד.

7. ניתוח נתונים ופרשנות

1. השתמש בנוסחה שניתנה על-ידי eq (1) כדי להמיר את הערכים המתקבלים באלפיות מעלות לאליפטיות שאריות.
   
   כאן, S הוא אות CD במילימעלות, c הוא ריכוז הדנ"א במ"ג/מ"ל, mRw הוא מסת השאריות הממוצעת, ו-l הוא אורך הנתיב בס"מ.
2. שרטט גרף כנגד אורך גל ואליפטיות שאריות ממוצעת באמצעות תוכנת התוויית הנתונים ונתח את הפסגות.
3. להתוות את התרשים, בחרו את האליפטיות הממוצעת של השאריות בציר Y ואת אורך הגל בציר X והתוו גרף בקו ישר.
   הערה: גרף זה יספק את הפסגות האופייניות של צורות שונות של דנ"א. ניתן לזהות את צורות הדנ"א המתאימות לפסגות באמצעות ספרות קיימת.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
אדנוזין 5′-טריפוספט דיסודיום מלח הידרט	זיגמאלדריץ'	A2383
CD קוורץ Cuvette	סטארנה	21-רב-1
ספקטרומטר תקליטורים Chirascan V100	פוטופיזיקה יישומית	לא זמין
EDTA מלח דיסודיום דיהידראט	SRL	43272
פתרון ניקוי Hellmanex III	הלמה	9-307-011-4-507
מגנזיום כלורי הקסהידראט	פישר סיינטיפיק	M33-500
נתרן פוספט דו-בסיסי נטול מים	פישר סיינטיפיק	S374-500
נתרן פוספט מונוהידראט מונובסיסי	פישר סיינטיפיק	S369-500
קורא מיקרו-צלחות HT Synergy	ביוטק	לא זמין
בסיס טריס	פישר סיינטיפיק	BP152-500