$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. הכינו בדיקות UV-Vis / Raman
- הכן פתרון AuNP חשוף
- הכינו תמיסה של 2 מ"ל של AuNPs בריכוז של כ 1 x 1011 חלקיקים למ"ל.
- אם יש צורך לרכז את ה-AuNPs, מלא צינורות צנטריפוגות בעלי קישור נמוך ב-2,000 μl של מלאי AuNP וצנטריפוגות ב-5,000 x גרם למשך 20 דקות או עד שהסופרנאטנט נקי. הסר את supernatant על ידי pipetting, נזהר לא להפריע את כדור AuNP.
- שלב את תמיסות AuNP הנותרות לצינור אחד והערך את הריכוז על ידי קבלת מדידת UV-Vis והשוואת ערכים לריכוזים ידועים מכיוון שזהו קשר ליניארי.
- קבע את יחס התיוג המתאים לכתב ראמאן
- הכינו פתרון עבודה של כתב הרמאן המומס במתנול. ריכוז זה יהיה תלוי בכתב שייעשה בו שימוש. בעבודה זו, להכין 3,3′-diethylthiatricarbocyanine יודיד (DTTC) בתמיסת עבודה של 200 מיקרומטר.
- בהנחה של נפח סופי של 100 μl עבור כל באר, להוסיף מספיק של פתרון כתב העבודה לכל באר של השורה הראשונה של צלחת 96 באר, כך כתב ראמאן ינוע בריכוזים בין 0.2 מיקרומטר ל 10 מיקרומטר. הוסף מספיק מים ברמת HPLC לכל באר כך שהנפח יהיה 80 μl. הוסף 20 μl של AuNP לכל באר מה שהופך נפח סופי של 100 μl עבור כל באר. דוגמה לכך מובאת בטבלה 1.
- מדוד את ספקטרום UV-Vis מ- 400 עד 700 ננומטר באמצעות ספקטרופוטומטר UV-Vis קורא לוחות. הריכוז המתאים הוא הריכוז הגבוה ביותר עם פסגות מוגדרות עבור ספקטרום UV-Vis. חזור על שלב 2.2.2 בריכוזים הולכים וגדלים עד שיימצא יחס הריכוז הגבוה ביותר של כתבי ראמאן ל- AuNPs.
הערה: הצבע והצורה, הגודל והיצרן של AuNP משפיעים על הריכוז המתאים. לכן, יש להעריך ולשנות את השלבים המפורטים בהתאם לרכיבים המשמשים. פרוטוקול זה כלל שימוש בצבע טעון חיובית. ככזה, הקשירה בין AuNP לבין הכתב שופרה על ידי שימוש ב- AuNPs טעונים שלילית. זה נעשה באמצעות AuNPs מכוסים ציטראט. עיין בסעיף הדיון לקבלת פרטים נוספים.
- כריכת כתב ראמאן ו-PEG-Ab ל-AuNP
- הכינו שתי אצוות של 1.5 מ"ל של כתב AuNP ו-Raman בריכוז שנקבע מראש, מה שמאפשר לכתב הרמאן להיקשר ל-AuNPs במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
- הוסף את הנוגדן PEGylated (PEG-Ab) לאצווה אחת של תמיסת הכתב AuNP ו- Raman כדי ליצור יחס של 200:1 בין נוגדנים לחלקיקים. פתרון זה יהיה עבור דגימות הבדיקה. בצינור מיקרוצנטריפוגה נפרד, הוסף את האנטיגן PEGylated לאצווה השנייה של תמיסת כתב AuNP ו- Raman ביחס של 200:1 בין נוגדנים לחלקיקים שישמשו כבקרה. לדגור על התמיסות למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
הערה: היחס בין נוגדנים לחלקיקים יהיה ספציפי ל-AuNPs ולצבע שבו נעשה שימוש ויש למטב אותו לכל מקרה בנפרד. המטרה כאן היא לקבל את היחס הגבוה ביותר של נוגדנים עבור בדיקות AuNP להיקשר תוך מניעת הצטברות של חלקיקים. השתמש במשוואה הבאה כדי לקבוע את אמצעי האחסון המתאימים לחיבור:
כאשר V הוא נפח, ו- C הוא ריכוז המתבטא בחלקיקים או נוגדנים למ"ל. נפח הסופי צריך להיות כ 1.5 מ"ל.
- חסום אתרים נותרים על משטח AuNP באמצעות mPEG-SH.
- הכינו mPEG-SH על ידי המסת פוליאתילן גליקול תיול מוצק לריכוז של 200 מיקרומטר באמצעות מים. מערבול את הפתרון עד mPEG-SH מומס לחלוטין.
- הוסף mPEG-SH ביחס של 40,000:1 לפתרון AuNP-PEG-Ab שנוצר בשלב 2.3. דגרו על התמיסה בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות כדי להבטיח שהאתרים הנותרים על ננו-חלקיק הזהב חסומים. השתמש במשוואה הבאה כדי לקבוע את אמצעי האחסון המתאימים לחיבור:
כאשר V הוא נפח, ו- C הוא ריכוז המתבטא בחלקיקים או נוגדנים למ"ל. נפח הסופי צריך להיות כ 1.5 מ"ל.
- לשחזר בדיקות ראמאן פונקציונליות.
- חלקיקי צנטריפוגות במהירות של 5,000 x גרם למשך 20 דקות בצינורות צנטריפוגות בעלי קישור נמוך או עד שהסופרנאטנט נקי. הסר את supernatant על ידי pipetting נזהר לא להפריע AuNPs.
- השהה מחדש את החלקיקים עם 1 מ"ל של תמיסת PBS 1x שיוצרה בעבר. הערך את ריכוז AuNP על ידי לקיחת מדידת UV-Vis של נפח קטן של תמיסה (3 μl) והשווה את התוצאות למדידות מריכוז AuNP ידוע. התאם את עוצמת הקול כך שהפתרון הסופי יהיה לפחות 1 x 1011 חלקיקים למ"ל.
- אחסנו את התמיסות בטמפרטורה של 4°C עד שהן משמשות לתפקוד הצלחת החיסונית. השתמש בפתרונות תוך שבוע.
טבלה 1. דוגמה לדילול DTTC. דילולים שונים של DTTC והנפחים הנלווים של מלאי DTTC, תמיסת ננו-חלקיקי זהב ומים.
| אמצעי אחסון להוספה של כל רכיב (ml) |
| ריכוז סופי DTTC (mM) | פתרון עבודה DTTC (200 mM) | AuNP | מים |
| 0.2 | 0.1 | 20 | 79.9 |
| 0.6 | 0.3 | 20 | 79.7 |
| 1 | 0.5 | 20 | 79.5 |
| 2 | 1.0 | 20 | 79 |
| 5 | 2.5 | 20 | 77.5 |
| 7 | 3.5 | 20 | 76.5 |
| 10 | 5.0 | 20 | 75 |
2. הכנת צלחת Immunoassay
- לקשור את האנטיגן הרצוי לצלחת immunoassay.
- הכינו מספיק אנטיגנים מדוללים (50 מיקרוגרם/מ"ל) כדי למלא את בארות הפוליסטירן. מערבלים את התמיסה, ומיד מוסיפים את הפתרון לבארות הצלחת. אפשר לאנטיגן להיקשר לצלחות למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר.
- לשטוף אנטיגנים לא קשורים.
- הסר את תמיסת האנטיגן העודפת על ידי השלכת התמיסה למיכל סילוק והטחת הצלחת על שולחן מכוסה מגבת נייר.
- הוסיפו TBST לבארות כדי לשטוף את המשטח ולאחר מכן הסירו את השטיפה באותו אופן כאמור. חזור על שלב זה פעמיים נוספות.
- חסום את אתרי הקשירה הנותרים בלוח כדי למנוע קשירה לא ספציפית.
- הוסיפו 70 מיקרוליטר של תמיסה חוסמת HSA לכל באר של הצלחת ודגרו בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.
- הסר ושטוף את הצלחת באותו הליך שצוין בשלב 3.2. מכסים את הצלחת ומאחסנים יבשים ב-4°C עד שהם מוכנים לשימוש נוסף.
- לתפקד את צלחת immunoassay.
- הוסף 70 μl של ננו-חלקיקי הגשושית שהוכנו בסעיף 2 לעמודה הראשונה של לוח 96 בארות ודלל את העמודות הבאות באמצעות דילול טורי 1:2. תנו לצלחת לדגור במשך שעה לפחות. דוגמה לאופן הכנת צלחת החיסון ניתנת באיור 1.
- שטפו את הצלחת עם TBST פי חמישה מהמפורט בשלב 3.2, והקפידו להשליך את ה-AuNPs כראוי. לאחר השטיפה הסופית, להוסיף 70 μl של 1x PBS לכל באר ולכסות עם חותם צלחת.
הערה: דוגמאות הבקרה צריכות להיות ברורות. אם בוצעה כריכה לא ספציפית, דגימות הבקרה יהיו בצבע דומה לדגימות הבדיקה.
- בדיקת רגישות על ידי ספקטרוסקופיית UV-Vis ורמאן.
- עבור כל באר, מדוד את ספקטרום UV-Vis הנע בין 400 ל -700 ננומטר באמצעות ספקטרופוטומטר UV-Vis קורא לוחות.
- באמצעות מיקרוסקופ ראמאן הפוך, מקדו את המטרה על פני השטח של הבאר שיש בה את הגשושיות AuNP. קבל ספקטרום ראמאן של הבאר. אספו ספקטרום שנע בין 1,800 ס"מ-1 ל-400 ס"מ-1. חזור על שלב זה עבור כל הבארות.
- באמצעות תוכנה ספקטרלית מתאימה, בצע תיקון קו בסיס פולינומי מסדר11 עבור ספקטרום ראמאן ופולינום מסדר3 עבור ספקטרום UV-Vis.
- באמצעות תוכנה ספקטרלית מתאימה, לנרמל את ספקטרום ראמאן ו- UV-Vis. הגדר את הערך המרבי ל- 1 ושנה את קנה המידה של כל שאר הערכים בהתאם. כדי לנרמל את ספקטרום הרמאן, בחר שיא פוליסטירן ייחודי והגדר אותו שווה ל- 1, ושנה את קנה המידה של כל שאר הערכים בהתאם.
- באמצעות תוכנה ספקטרלית מתאימה, בצע שילוב שיא עבור כל ספקטרום. עבור ספקטרום ראמאן, הפסגה המייצגת את כתב הרמאן חייבת להיות באזור נעדר פסגות פוליסטירן. לביצוע שילוב שיא, ציין את גבולות האינטגרל לשיא הרצוי ורשום את אזור השיא הרצוי לכל הדגימות, כולל הפקדים.
- התווה את אזור שיא העניין הממוצע כפונקציה של יומן ריכוז AuNP עם קווי שגיאה עבור כל נקודה המציינים את סטיית התקן המשויכת אליה. התאימו את נקודות הכיול הללו לעקומה לוגיסטית בת 4 פרמטרים.
- קבע את הערך הממוצע של הערך הריק על-ידי ממוצע השטח של שיא העניין עבור מדגם ריק. לקבוע את סטיית התקן של אזורים אלה; זוהי סטיית התקן של הריק.
- עבור אותו שיא שנותח בשלב הקודם, מצא את סטיית התקן של אותו אזור שיא עבור הריכוז הנמוך ביותר.
- חשב את המגבלה של הגבול הריק והתחתון של הזיהוי כפי שצוין בסעיף תוצאות מייצגות. השתמש בערכים אלה עם עקומות הכיול 4PL כדי לקבוע את LLOD במונחים של ריכוז AuNP.
