איתור קישור ויטרונקטין למשטחים חיידקיים באמצעות ציטומטריית זרימה

Abstract

מקור: Singh, B. et al., Assays for Study the role of Vitronectin in Bacterial Adfusion and Serum Resistance.J. Vis. Exp.(2018)

סרטון זה מדגים את זיהוי האינטראקציה של ויטרונקטין עם חלבוני פני השטח של חיידקים. ניתוח ציטומטריית הזרימה מודד את האות הפלואורסצנטי של נוגדנים המסומנים באופן פלואורסצנטי הקשורים לויטרונקטין, ומאשר את נוכחותו על פני השטח של החיידקים. טכניקה זו מספקת תובנות לגבי אינטראקציות מארח-פתוגן וטיפולים פוטנציאליים בזיהום חיידקי.

Protocol

1. אנליזה של ויטרונקטין, Vn כליגנד חלבון פני השטח של חיידקים

1. איתור קשירת Vn על פני השטח של החיידקים באמצעות ציטומטריית זרימה
   הערה: בציטומטריית זרימה, השתמשנו בפיזור צדדי ובפיזור קדימה כדי לשער אירועים חיוביים. כדי לבחון את האינטראקציות עם Vn, המופילוס אינפלואנזה מסוג f, מבודדים קליניים של Hif (n = 10) נבחרו יחד עם E. coli BL21 (DE3) כביקורת שלילית (איור 1A).
   1. מבודד קליני של תרבית Hif בעירוי מוח-לב (BHI) בתוספת 10 מיקרוגרם/מ"ל ניקוטין-אמיד אדנין דינוקלאוטיד (NAD) והאמין ב-37°C עם רעידות ב-200 סל"ד. השתמש במדיום לוריא-ברטאני לתרבית E. coli. קציר Hif בשלב אמצע היומן (צפיפות אופטית, OD₆₀₀ = 0.3), והשהה מחדש את החיידקים במי מלח חוצצי פוספט (PBS), pH 7.2, המכיל 1% (w/v) אלבומין בסרום בקר (BSA) (חיץ חוסם; PBS-BSA). כוונן את המתלים ל-10⁹ יחידות יוצרות מושבה, CFU/מ"ל.
   2. העבר את aliquots המכילים 5 x 10⁶ CFU ל 5 מ"ל פוליסטירן צינורות עגולים למטה (12 x 75 מ"מ²) ולהוסיף 1 מ"ל של חיץ חוסם. צנטריפוגה את התרחיף ב 3,500 × גרם בטמפרטורת החדר (RT) במשך 5 דקות כדי לגלול את החיידקים, ולאחר מכן בזהירות לשאוף להסיר את supernatant מבלי להפריע את הכדור.
   3. השהה מחדש את כדוריות החיידקים עם 50 μL של חיץ חוסם המכיל 250 ננומטר Vn ודגר על הדגימות במשך שעה אחת ב- RT מבלי לרעוד. לאחר הדגירה, יש לשטוף את החיידקים באמצעות צנטריפוגה במהירות של 3,500 x גרם למשך 5 דקות, ולאחר מכן לשטוף את הכדורים שלוש פעמים באמצעות PBS ושלבי צנטריפוגה דומים.
   4. לכדורית החיידקית, הוסף 50 μL של נוגדנים רב-שבטיים Vn אנטי-אנושיים ראשוניים (pAbs) בדילול 1:100 ב-PBS-BSA. דגור על התרחיף במשך שעה אחת ב- RT, ולאחר מכן שטוף את החיידקים שלוש פעמים עם PBS כדי להסיר נוגדנים לא קשורים (כמתואר בשלב 1.1.3).
   5. לאחר מכן, הוסף 50 μL של PBS-BSA המכיל פלואורסצאין איזותיוציאנט (FITC) - חמור מצומד נגד כבשים pAbs (דילול 1:100) ודגור ב- RT במשך שעה אחת בחושך.
   6. הכינו בקרה ריקה על ידי דגירה של חיידקים עם חיץ חוסם בלבד ו- pAbs ללא Vn.
   7. לשטוף חיידקים שלוש פעמים עם 1 מ"ל של חיץ חוסם גלולה את ההשעיה על ידי צנטריפוגה, כמתואר בסעיף 1.1.2. לבסוף, להשעות מחדש את גלולת החיידקים עם 300 μL של PBS ולנתח אותו על ידי ציטומטריית זרימה.

Results

איור 1: Haemophilus influenzae serotype f קושר Vn באמצעות PH מבוטא על פני השטח.(A) תוצאות ציטומטריית זרימה המראות קשירה של Vn לתאים של מבודדים קליניים של Hif. כל בידוד קליני (5 x 10⁶ CFU) הודגר עם Vn אנושי של 250 ננומטר. הליגנד הכבול זוהה באמצעות נוגדנים משניים נגד Vn של כבשים ונוגדנים משניים נגד חמורים מצומדים FITC. Escherichia coli BL21...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
5 מ"ל פוליסטירן צינור תחתון עגול	BD בז	60819-138	סגנון 12 × 75 מ"מ
אלבומין בסרום בקר (BSA)	סיגמא-אולדריץ'	A2058	מתאים לתרבית תאים
ציטומטר זרימה	BD Biosciences	651154	ציון אנליזת תאים ליישומי מחקר
ויטרונקטין (Vn) מפלזמה אנושית	סיגמא-אולדריץ'	V8379-50UG	כיתה בתרבית תאים
מארח E. coli (E. Coli BL21)	נובאגן	69450-3	מארח ביטוי חלבונים
נוגדנים מצומדים לחמור נגד כבשים	עבד סרוטק	STAR88F	רב-שבטי
נוגדני Vn אנטי-אנושיים של כבשים	עבד סרוטק	AHP396	רב-שבטי