$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. ברקוד של תאי דם Lysed/Fixed
- הפשירו באיטיות את דגימות התאים הקבועים מהאחסון בטמפרטורה של -80°C על קרח; ניתן לתייג עד 20 דגימות בברקודים ייחודיים ולאגד אותן באמצעות מערכת זו. לדלל את מאגר פרם ברקוד 10X על ידי 1:10 עם PBS; לעשות מספיק חיץ עבור ~ 3 מ"ל לדגימה.
- מלא שוקת לא סטרילית אחת עם CSM ואחת עם חיץ פרם ברקוד 1X. הוסף 1 מ"ל של CSM קר כקרח לדגימות מופשרות טריות, ערבב היטב עם פיפטה והעבר לצינורות אשכול הפוליפרופילן המתאימים המסומנים מראש.
- קח דגימה של 10 μL כדי לספור תאים באמצעות מונה תאים אוטומטי או המוציטומטר. נרמל את ספירת התאים ל 1.5-2 x 106 תאים לדגימה בכל צינור אשכול: להסיר ולהשליך את נפח התאים העודפים מעל 2 x 106 תאים.
- צנטריפוגה את התאים ב 600 x גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. השהה מחדש את התאים ב 1 מ"ל של 1X ברקוד חיץ פרם עם פיפטה רב ערוצית וצנטריפוגה ב 600 x גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. שאפו מהסופר-נאנט.
- סדרו את צינורות האשכול בארון תקשורת באותו סדר כפי שמצוין במפתח הברקוד, כך שהדגימה תתאים לברקוד שלה. הוסף 800 μL 1X חיץ פרם ברקוד על ידי פיפטה רב ערוצית לכל הדגימות בצינורות האשכול מבלי לגעת בכדורית התא עם קצות פיפטה (ללא ערבוב) כדי להפחית את אובדן התא. הניחו בצד את המדף עם צינורות האשכול.
- יש להסיר את רצועות הצינור של ערכת ברקוד Pd 20-plex מ-20°C ולהפשיר בטמפרטורת החדר. הוסף 100 μL של חיץ פרם ברקוד 1X, ערבב היטב והעבר 120 μL של תערובת הברקוד המושעה מחדש לדגימות התאים המתאימות בצינורות האשכול.
- מערבבים היטב על ידי פיפטה רב ערוצית, כך שאין זיהום צולב בין דגימות ברקוד בנפרד. דגרו על צינורות אשכול במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר כדי לאפשר לברקודים לסמן את התאים.
- צנטריפוגה ב 600 x גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. לשאוף את supernatant, ולאחר מכן resuspend ב 1 מ"ל של CSM.
- צנטריפוגה והשעיה מחדש ב- CSM שוב.
הערה: כל דגימה מסומנת כעת בברקוד ייחודי, והדגימות מוכנות לאיגום.
- צנטריפוגה ב 600 x גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר ולשאוף את supernatant. בעזרת פיפטה אחת ושימוש באותו חוד, מעבירים את כל כדורי התא בנפח שיורי ~70-80 μL לצינור פוליסטירן אחד. אין להוציא את קצה הפיפטה; הניחו בצד את הפיפטה הבודדת עם הטיפ הזה.
- עם פיפטה רב-ערוצית וטיפים חדשים, הוסף ~ 100 μL CSM לכל צינור אשכול מקורי כדי למקסם את התאוששות התא. עם פיפטה אחת עם הקצה שהונח בצד, להעביר את כל כדורי התא בנפח שיורי ~ 100 μL לאותו צינור פוליסטירן.
- הוסף CSM לראש צינור הפוליסטירן (~ 3 מ"ל). ספור ורשום את מספר התא של ערכת הברקוד המאוגמת. צנטריפוגה ב 600 x גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר ולשאוף את supernatant. המשך להכתים את דגימות הברקוד באותו יום.
הערה: זה נורמלי לצפות ~ 20-30% אובדן תאים בתהליך ברקוד.
2. צביעת תאי דם מקודדים/קבועים והכנה לאנליזה על מכשיר ציטומטריית מסה
הערה: כל טיטר 1X של נוגדן מכתים (1 μL של נוגדן לכל 100 μL תגובת צביעה), יכול בדרך כלל להכתים 3-4 x 106 תאים. לכן, כאשר כל דגימות הברקוד מאוגדות לצינור אחד, יש להגדיל את כמות הנוגדנים. אם 20 דגימות ברקוד מסתכמות ב 30 x 106 תאים, וכל טיטר 1X יכול להכתים 3-4 x 106 תאים, הדגימה בברקוד דורשת רק 10X titer, בניגוד להכתמת כל דגימה בנפרד, אשר ידרוש כמות של 20X של נוגדנים (1X לכל צינור בודד). ריכוז הנוגדן למספר התא צריך להיות טיטרציה קפדנית עבור כל קוקטייל נוגדנים בודד (לא נדון כאן).
- לצבוע את התאים באמצעות נוגדנים (טבלה של חומרים) עבור צביעת פני השטח והשראת ציטוקינים.
- הכינו את קוקטייל צביעת פני השטח על ידי חישוב הכמות שיש להוסיף והתחשבות בטעות הצביעה (כלומר, אם צביעה של 20 דגימות ברקוד של 2 x 106 תאים בכל דגימה, נדרש כתם טיטר 10X; לחישובי נפח סופיים, פצו על טעות הפיפטינג על ידי ביצוע פתרון צביעה סופי פי 10.5).
- הוסף נפח צביעת משטח בשווי פי 10 לכדורית התא המקודדת. כדי להפחית את אובדן התאים, עם אותו קצה, ערבבו ומדדו את נפח הכתמים על פני השטח וכדורי התא.
- בהתבסס על נפח התאים וקוקטייל הצביעה, הוסף CSM לנפח צביעה סופי של 50 μL למספר דגימות תאים (כלומר, אם מריצים קבוצה של 20 דגימות, 50 μL X 20 = 1 מ"ל). יש לדגור במשך 30 דקות בטמפרטורה של 4°C. יש לערבב את הדגימה כל 15 דקות כדי לקדם כתמים אחידים.
- במהלך הדגירה של הכתם על פני השטח, הכינו את חיץ Perm/Wash (טבלת חומרים) על ידי דילול 1:10 עם ddH2O מסונן. הכינו נפחים של 2 מ"ל לחדירה ו-5 מ"ל לשטיפה. יש לשמור על טמפרטורה של 4°C או על קרח.
- מעל צינור הצביעה עם CSM, וצנטריפוגה ב 600 x גרם ב 4 ° C במשך 5 דקות. לשאוף את supernatant. השהה מחדש את הדגימה הברקודית ב- 2 מ"ל של 4 ° C, 1:10 דילול Perm/Wash buffer. יש לדגור בטמפרטורה של 4°C למשך 20-30 דקות כדי לחדור באופן מלא לתאים.
- צנטריפוגה ב 600 x גרם ב 4 ° C במשך 5 דקות ולשאוף את supernatant.
- עבור צביעה תוך תאית, בצע שלבי צביעה דומים (כמו צביעה על פני השטח). עם זאת, השתמש במאגר Perm/Wash דילול 4°C, 1:10 במקום CSM כדי להפוך את נפח הצביעה הכולל כך שהתאים יישארו בסביבה מחדירה לאורך הצביעה התוך-תאית.
- הוסף את קוקטייל הנוגדנים התוך תאי למשטח המוכתם והחדיר של כדור התא (שלבים 2.1.2-2.1.7). הביאו את נפח הצביעה הכולל ל-50 מיקרוליטר למספר דגימות תאים. יש לדגור במשך 60 דקות בטמפרטורה של 4°C. יש לדגור את הדגימה כל 15 דקות כדי להבטיח כתמים אחידים.
- במהלך הצביעה התוך-תאית, הכינו את תמיסת האינטרקלטור: 900 מיקרוליטר PBS מסונן + 100 מיקרוליטר של 16% PFA מסונן (ריכוז סופי של 1.6% PFA) + 0.2 מיקרוליטר של 500 או"מ של צבע אינטרקלטור (טבלת חומרים).
- מעל גלולת התא + קוקטייל נוגדנים תוך תאי עם חיץ פרם / שטיפה קר 1:10.
- צנטריפוגה ב 600 x גרם ב 4 ° C במשך 5 דקות, ולשאוף את supernatant. מעל צינור הצביעה עם CSM. ספור ורשום את מספר התא. צנטריפוגה ב 600 x גרם ב 4 ° C במשך 5 דקות, ולשאוף את supernatant. להשעות מחדש את התאים ב 1 מ"ל של פתרון intercalator משלב 4.9. יש לדגור לפחות 20 דקות בטמפרטורת החדר לאינטרקלציה מלאה או ללילה ב-4°C (דגימות בתמיסת אינטרקלטור יכולות להישאר ב-4°C עד שבוע לפני הפעלתן במכשיר ציטומטריית המסה).
- הכינו את התאים למכשיר ציטומטריית המסה.
- מעל הצינור עם 3 מ"ל של ddHמסונן 2O, וצנטריפוגה ב 600 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C. להשעות מחדש את התאים ב 3 מ"ל של ddHמסונן 2O. להעביר את המתלה דרך מסנן 100 מיקרומטר כדי להסיר כל פסולת או אגרגטים שעלולים לסתום את מכשיר ציטומטריית המסה.
- ספור ורשום את מספר התא לאחר הסינון. צנטריפוגה ב-600 x גרם למשך 5 דקות ב-4°C
- הכינו את תמיסת חרוזי הכיול (טבלת חומרים) על ידי דילול 1:10 ב-ddH2O מסונן.
- השהה מחדש את התאים המוכתמים בנפח הנדרש של תמיסת חרוזי כיול מדוללת 1:10 כדי להשיג ריכוז תאים של ~ 1 x 106 תאים/mL.
הערה: עבור CyTOF1 ב 45 μL / דקה, האופטימלי המומלץ הוא 5 x 105 תאים / מ"ל; עבור הליוס ב 30 μL / דקה, 7.5 x 105 תאים / מ"ל.
- המשך להריץ את הדגימה במכשיר ציטומטריית המסה.