בדיקת ברקוד לאפיון פנוטיפי ופונקציונלי של תאי מערכת החיסון

תקציר

מקור: Baxter, R. M., et al. אנליזה של תא יחיד של אימונופנוטיפ וייצור ציטוקינים בדם שלם היקפי באמצעות ציטומטריה מסה. J. Vis. Exp. (2018).

סרטון זה מדגיש שיטה פרוטאומית חד-תאית המשתמשת בנוגדנים מצומדים במתכת כבדה לברקוד תאים מובחן. לאחר מכן, immunostaining ו cytometry המסה מוחלים כדי להעריך שינויים פנוטיפיים חיסוניים ותפקודיים בתאי חיסון אנושיים שמקורם בדם שלם.

פרוטוקול

1. ברקוד של תאי דם Lysed/Fixed

1. הפשירו באיטיות את דגימות התאים הקבועים מהאחסון בטמפרטורה של -80°C על קרח; ניתן לתייג עד 20 דגימות בברקודים ייחודיים ולאגד אותן באמצעות מערכת זו. לדלל את מאגר פרם ברקוד 10X על ידי 1:10 עם PBS; לעשות מספיק חיץ עבור ~ 3 מ"ל לדגימה.
2. מלא שוקת לא סטרילית אחת עם CSM ואחת עם חיץ פרם ברקוד 1X. הוסף 1 מ"ל של CSM קר כקרח לדגימות מופשרות טריות, ערבב היטב עם פיפטה והעבר לצינורות אשכול הפוליפרופילן המתאימים המסומנים מראש.
3. קח דגימה של 10 μL כדי לספור תאים באמצעות מונה תאים אוטומטי או המוציטומטר. נרמל את ספירת התאים ל 1.5-2 x 10⁶ תאים לדגימה בכל צינור אשכול: להסיר ולהשליך את נפח התאים העודפים מ....

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
רוקסוליטיניב	סנטה קרוז	SC-364729A	מלאי Conc: 10 mM; קונק סופי: 5 מיקרומטר
₪220	אינוויווגן	TLRL-R848-5	קונק במלאי: 1 מיקרוגרם/μL; קונק סופי: 1 מיקרוגרם/מ"ל
LPS-EK	אינוויווגן	TLRL-EKLPS	קונק במלאי: 1 מיקרוגרם/μL; קונק סופי: 0.1 מיקרוגרם/מ"ל
PBS סטרילי	לונזה	17-516F
Lyse/Fix Buffer	BD biosciences	558049	קונק מלאי: פי 5; קונק סופי: 1X (מדולל ב-ddH2O)
BD Phosflow perm/wash buffer I	BD biosciences	557885	קונק מלאי: פי 10; קונק סופי: 1:10 (מדולל ב-ddH2O)
סל"ד	גיבקו	21870-076
נתרן אזיד (NaN3)	סיגמא-אולדריץ'	S-8032	מניית Conc:>99.9%; קונק סופי: 0.0002
מעכב העברת חלבונים (PTI)	eBiosciences	00-4980-93	קונק מלאי: פי 500; קונק סופי: 1X
אינטרקלטור DNA	פלואידים	201192ב	קונק מלאי: 500 מיקרומטר; קונק סופי: 0.1 מיקרומטר
מאגר פרם ברקוד MaxPar	פלואידים	201057	קונק מלאי: פי 10; קונק סופי: 1X
סט ברקוד Pd 20-plex	פלואידים	S0014	מלאי Conc: n/a; קונק סופי: n/a
נוגדנים המשמשים לציטומטריית מסה
סמני פני שטח
CD1c	ביואגדה	L161	מסה: 161
CD3	ב.ד.	UCHT1	מסה: 144
CD4	ביואגדה	SK3	מסה: 174
CD7	ב.ד.	M-T701	מסה: 149
CD8	ביואגדה	SK1	מסה: 142
CD11b	פלואידים	ICRF44	מסה: 209
CD11c	ב.ד.	B-ly6	מסה: 152
CD15	ב.ד.	HI98	מסה: 115
CD14	ביואגדה	M5E2	מסה: 154
CD16	eBioscience/Thermo	B73.1	מסה: 165
CD19	סנטה קרוז	SJ25C1	מסה: 163
CD21	ביואגדה	צרפת	מסה: 141
CD27	ב.ד.	L128	מסה: 155
CD38	פלואידים	HIT2	מסה: 172
סה"כ CD45	ביואגדה	HI30	מסה: 89
CD45RA	ביואגדה	HI100	מסה: 153
CD56	מילטני	REA196	מסה: 168
CD66	ב.ד.	B1.1/CD66	מסה: 113
CD86	פלואידים	IT2.2	מסה: 150
CD123	פלואידים	6H6	מסה: 143
CD278/ICOS	ביואגדה	C398.4A	מסה: 156
CD179/PD1	ביואגדה	EH12.2H7	מסה: 162
יגד	ביואגדה	IA6-2	מסה: 146
IgM	ביואגדה	MHM-88	מסה: 151
CXCR5	ב.ד.	RF8B2	מסה: 173
חלאדר	ביואגדה	L243	מסה: 167
ציטוקינים
IL-1α	ביואגדה	364-3B3-14	מסה: 147
IL-1β	ביואגדה	H1b-98	מסה: 169
IL-1RA	סנטה קרוז	AS17	מסה: 157
IL-6	ביואגדה	MQ2-13A5	מסה: 164
IL-8	ב.ד.	E8N1	מסה: 160
IL-12/IL-23P40	ביואגדה	ג8.6	מסה: 171
IL-17A	ביואגדה	BL168	מסה: 148
IL23p19	eBioscience/Thermo	23DCDP	מסה: 176
MIP1β	ב.ד.	D21-1351	מסה: 158
MCP1	ב.ד.	5D3-F7	מסה: 170
IFNα	מילטני	LT27:295	מסה: 175
IFNγ	ביואגדה	4S.B3	מסה: 165
PTEN	ב.ד.	A2B1	מסה: 159
TNFα	ביואגדה	צרפת	מסה: 166
הערה: אם היצרן מצוין כ-Fluidigm, נוגדן זה נרכש מ-Fluidigm עם מתכת מצומדת מראש. אם היצרן מוצהר כשונה מ- Fluidigm, נוגדן זה צומד מעצמו באמצעות ערכת התיוג הרב-מתכתית MaxPar (Fluidigm Cat: 201300) בהתאם לפרוטוקול היצרן.