איתור חלבוני פריון חריגים ברקמת המוח באמצעות אימונוהיסטוכימיה

Abstract

מקור: Orge, L., et al. Detection of Abnormal Prion Protein by Immunohistochemistry. J. Vis. Exp. (2023).

סרטון זה מדגים טכניקה לזיהוי חלבון פריון מקופל באופן שגוי בקטעי מוח באמצעות אימונוהיסטוכימיה. לאחר טיפול במקטע המוח עם חומצה פורמית כדי לנטרל פריונים ולמזער את הסיכון לזיהום, כמו גם הסרת המסכה של אגרגטי הפריון באמצעות שליפת אפיטופים הנגרמת על ידי חום, החלקים מסומנים חיסון עבור צברי חלבון פריון מקופלים בצורה שגויה ונצפים תחת מיקרוסקופ.

Protocol

1. חתך רקמות והכנת שקופיות

1. חתכו מקטעים של רקמות מקובעות פורמלין, משובצות פרפין (FFPE) בעובי 3-5 מיקרומטר באמצעות מיקרוטום.
2. יש לצוף על גבי מים מטוהרים בטמפרטורה של כ-10 מעלות צלזיוס מתחת לנקודת ההתכה של הפרפין בו משתמשים. הרימו את המקטעים מהמים אל שקופיות מיקרוסקופ שטופלו במיוחד (ראו טבלת חומרים). אפשר למים להתנקז היטב מהמגלשות.
3. לדגור על המגלשות במשך הלילה ב 50 ° C כדי לשפר את הידבקות שקופיות של רקמות.
   הערה: עדיף להכין רקמות חתוכות טריות לפרוטוקולי IHC, אם כי ניתן להכין מראש קטעי בקרה חיוביים ושליליים של TSE ולאחסן. שלבים 2 עד 4 חייבים להתבצע במכסה אדים כימי.

2. דה-פרפיניזציה והתייבשות

1. הניחו את השקופיות עם חלקי הרקמה בסלסלת צביעה מפלדת אל-חלד (ראו טבלת חומרים). טובלים את הסלסלה באמבט קסילן (מיכל צביעת נירוסטה) למשך 3 דקות, מוציאים וטובלים שוב.
2. הסר קסילן ולהחזיר לחות חלקים על ידי טבילתם באמבט אתנול מוחלט במשך 3 דקות. להסיר ולטבול שוב.
3. ייבשו באוויר את החלקים והכניסו לאמבט אתנול 90% למשך דקה. העבירו לאמבט אתנול 70% למשך דקה נוספת, ולאחר מכן העבירו לאמבט אתנול 50% למשך דקה. בכל טיפול באמבט אתנול, יש לסרוק בעדינות את סל המגלשה פעמיים ולרוקן את הסלסלה לפני ההעברה הבאה.

3. שליפת אפיטופים

1. יש לטבול בזהירות את חלקי הרקמה בחומצה פורמית 98% בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. לשטוף את המקטעים במי ברז במשך 5 דקות, ולאחר מכן לשטוף פעמיים במים מזוקקים.
   זהירות: חומצה פורמית היא חומר מאכל מאוד. יש ללבוש משקפי מגן וכפפות.
2. בצע אחזור אנטיגן המושרה בחום (HIER) לפי השלבים הבאים.
   הערה: שלב זה מבוצע על ידי autoclaving hydrated ב 121 ° C במשך 30 דקות בתא לחץ מסוים (ראה טבלה של חומרים).
   1. חממו מראש את חיץ הציטראט (10 mM, pH 6.1, ראו טבלת חומרים) ב-98°C למשך כ-20 דקות במיכל צביעת נירוסטה הממוקם בתוך תא הלחץ המלא ב-500 מ"ל מים מזוקקים.
      הערה: עבור המחקר הנוכחי, התוכנית Set Point הייתה 1 (SP1) עבור הציוד הספציפי בו נעשה שימוש.
   2. לאחר שהאזעקה מציינת שהציוד השיג את הזמן והטמפרטורה המתוכנתים, טבלו את הסל בשקופיות והפעילו את התוכנית לנקודה 2 (121 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות). למטרות בקרת איכות, הניחו על הסל קטע של סרט חיווי אוטוקלאבי דביק כדי לפקח על הטמפרטורה והלחץ, ולהקליט את הלחץ הראשוני והסופי של תוכנית זו.
   3. אם מספר המגלשות שיש לצבוע בהן חיסון אינו מגיע לקיבולת הסל, השתמש בשקופיות נקיות וריקות כדי לתפוס מיקומים ריקים. לאחר סיום התוכנית, אפשר חזרה פסיבית של התא ללחץ הסביבה (לפחות 30 דקות).
      הערה: משכי זמן ארוכים יותר עשויים להפחית כתמים לא ספציפיים ברקע.
   4. מעבירים בזהירות את סלסלת השקופיות למיכל צביעה מנירוסטה מלא במים מזוקקים למשך 5 דקות.

4. השבתה של peroxidase אנדוגני

1. יש לטבול את סלסלת המגלשה המכילה את חלקי הדגימה באמבטיה של 3% מי חמצן (H₂O₂) במתנול למשך 30 דקות. לשטוף את המקטעים תחת מים זורמים (5 דקות). סננו וטבלו את החלקים במי מלח חוצצים (TBS) למשך 5 דקות נוספות.

5. זיהוי חיסוני

הערה: במחקר הנוכחי, זיהוי חיסוני בוצע באמצעות פורמט מרווח נימי באמצעות מערכת הרכבה מסחרית של קליפ שקופיות (ראה טבלת חומרים). מערכות שקופיות אימונוהיסטוכימיות אחרות ישימות גם כן.

1. הניחו כל שקופית על מחזיק לוחית כיסוי זמין מסחרית (ראו טבלת חומרים) רטוב מראש עם TBS, תוך הימנעות מבועות, כאשר צד הרקמה פונה למחזיק וקצוות ההחלקה חופפים לשתי הנקודות התחתונות של המחזיק.
   1. החזק את מכלול מחזיק השקופיות בין האגודל לאצבע המורה, כאשר אצבע אחת נמצאת מעל השקופית לדוגמה והשנייה בתחתית המחזיק. לאחר מכן, מקם את ההרכבה בגלריה של המערכת.
   2. כדי להבטיח שהערכה מורכבת היטב, מלא את הבאר בין השקופית לדוגמה לבין המחזיק ב- TBS, שאסור שיגלוש מיד. מנקודה זו ואילך, ודא שיש לשמור כ- 80 μL של TBS בין המחזיק לבין המגלשה. אין לאפשר לחלקים להתייבש.
2. לאחר הכניסה למערכת, כדי להפחית את צביעת הרקע לפני הטיפול בנוגדן ראשוני (נוגדן נגד חלבוני פריון (anti-PrP), ראה טבלת חומרים), יש לדגור מראש על שקופיות הדגימה עם 20% סרום תקין מאותו מין כמו המארח הנוגדן המשני המשמש להצבת חיסון (במקרה הנוכחי, נסיוב סוסים) למשך 30 דקות ב- TBS.
3. הפשירו את מספר הנוגדנים שיש להשתמש בהם בהתאם למיני בעלי החיים הנבדקים, מספר חלקי הדגימה שיש לבדוק וכמות דילול העבודה.
   הערה: לקבלת התוצאות הטובות ביותר, יש להשתמש בסרום 10% רגיל מאותו זן כמקור הנוגדן המשני ותמיסות הנוגדנים הראשוניות. במידת האפשר, לקבלת התוצאות הטובות ביותר, המקור המארח של הסרום הרגיל והנוגדן המשני צריך להיות מאותו מין.
4. מבלי לשטוף את המקטעים, יש למרוח את תמיסת הנוגדנים הראשונית ישירות (200 μL) בכל באר של ערכת מחזיק השקופיות ולדגור במשך 60 דקות בטמפרטורת החדר.
5. לשטיפה, מלאו את הבארות של ערכות מחזיקי המגלשות ב-TBS והמתינו 5 דקות. חזרו על הפעולה פעמיים.
6. לדלל את הנוגדן המשני biotinylated (monoclonal anti-murine Horse Ab, ראה טבלה של חומרים) ב 1/200 ב TBS עם 10% סרום סוס. הכינו את הנפח הנדרש בהתאם למספר הסעיפים שיש לטפל בהם.
7. החל את תמיסת הנוגדנים המשנית (200 μL) על כל באר של ערכת מחזיק השקופיות. יש לדגור במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
8. יש לכבס כמתואר בשלב 5.5.
9. לדגירה עם תרכובת אבידין-ביוטין פרוקסידאז (קומפלקס ABC/HRP, ראו טבלת חומרים), הכינו את המגיב 30 דקות לפני השימוש. החל את הפתרון המורכב ABC/HRP (200 μL) בכל באר של ערכת מחזיק לוחות השקופיות. יש לדגור במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
10. יש לכבס כמתואר בשלב 5.5.

6. התפתחות עם כרומוגן דיאמינובנזידין (DAB) 3,3'

זהירות: DAB הוא מסרטן פוטנציאלי. כתוצאה מכך, יש צורך בטיפול מתאים בעת עבודה עם מגיב זה, כולל הגנה על העיניים, מעילי מעבדה, כפפות, ונהלי מעבדה טובים. יש להשליך את התקנות המקומיות הבאות.

1. יש לדלל כרומוגן בהתאם להוראות היצרן (ראה טבלת חומרים) מיד לפני השימוש. החל את תמיסת הכרומוגן (400 μL) על כל באר של ערכת לוחות השקופיות.
2. יש לדגור עד 30 דקות בטמפרטורת החדר. במקטעים חיוביים של PrP^Sc (איזופורם חריג של חלבוני פריון), תקופת דגירה של 10 דקות מספיקה בדרך כלל.
3. הסר את תמיסת הכרומוגן השיורית על ידי שטיפת המגלשות במים מזוקקים. הסירו את המגלשות ממחזיקי הכיסוי והניחו אותן במיכל פלסטיק עם מים מזוקקים.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
אתנול מוחלט	לאבכם	LB0507-9010	לא מדולל
			מדולל 90%, 70% ו-50% במים מזוקקים
תרכובת אבידין-ביוטין ופרוקסידז ערכת Vectastain Elite ABC Peroxidase	מעבדות וקטוריות	PK-6100	יש להכין ולערבב בעדינות 30 דקות לפני השימוש בהתאם להוראות הערכה. אין לערבב לאחר עמידה.
נוגדן משני ביוטינילציה (IgG H+L נגד עכבר סוס)	מעבדות וקטוריות	BA-2000-1.5	יש לדלל ב-1/200 ב-TBS עם 10% סרום רגיל לסוס. הכן את אמצעי האחסון הנדרש בהתאם למספר המקטעים.
כרומוגן דיאמינובנזידין- DAB, ערכת מצע, פרוקסידז	מעבדות וקטוריות	SK-4100	יש להכין לפני השימוש בהתאם להוראות הערכה. השתמש 400 μL של תמיסה לכל קטע.
תא לחץ פסקל DakoCytomation	דקו	S2800
המטוקסילין של ארליך:
אתנול מוחלט	לאבכם	LB0507-9010
חומצה אצטית קרחונית	מרק	101830
אשלגן אלום	מרק	1.01047.1000
גליצרין	מרק	1.04091.1000
תמיסת בלוק פרוקסידאז אנדוגנית (ריכוז 3% H2O2):			40 מ"ל מי חמצן (30% w/w) ב 360 מ"ל מתנול. יש להכין לפני השימוש
מי חמצן (30% w/w)	שרלאו	HI0136
מתנול	סיגמא אולדריץ'	322415-2L
חומצה פורמית 98%	מרק	1.00264.1000	לא מדולל
מיקרוטום	שנדון-AS325	מיקרוטום	שנדון-AS325
תמיסת בלוק רגילה בסרום (20%) ב-TBS: סרום רגיל לסוסים	גיבקו	16050-122	הכנת נפח סופי לפי מספר הקטעים ב- assay (200 מיקרוליטר תמיסה לכל קטע).
נוגדן ראשי נגד PrP עכבר MAb 2G11	בירד	MCA2460	PrP 146-R154R171182 שחלה כולל שריטה לא טיפוסית, cervine, חתול. לא מתאים לשור. על פי מספר הסעיפים בבדיקה (200 מיקרוליטר תמיסה לכל קטע) ודילול נוגדנים, הכינו נפח סופי ב-TBS בתוספת 10% מהסרום התקין מהמין בו הועלה הנוגדן המשני (סרום תקין לסוס) דילול נוגדנים רגיל: MAb 2G11 1/100 אך יש לבסס דילול עובד בכל אצווה חדשה כדי לקבל את הריכוז לתת את התיוג החזק ביותר עם הרקע הנמוך ביותר. לאחסון, להקפיא נפחי aliquot של מינימום של 10 μL לתוך microtubes סטרילי. להפשיר ולהשתמש aliquot אחד בכל פעם.
נוגדן ראשי נגד PrP עכבר MAb 12F10	חברת הכימיקלים קיימן	189710	PrP142-160 בקר, לא מתאים ovine דילול נוגדנים רגיל: 1/200 אך יש לקבוע גם דילול עבודה. הכנה כ-MAb 2G11
תא Shandon CoverplateTM	תרמו סיינטיפיק	72110017
Shandon Sequenza® Immunstaining מרכז	תרמו סיינטיפיק	73300001
Shandon Sequenza® מתלה שקופיות Immunstaining	תרמו סיינטיפיק	73310017
חיץ ציטראט תמיסה (10 mM pH 6.1):			2.55 גרם Tri-sodium citrate dihydrate ו-0.255 גרם חומצת לימון בליטר אחד מים מטוהרים. התאם את רמת החומציות של תמיסת העבודה ל-6.1 באמצעות תמיסת חומצת לימון של 10 mM (1.05 גרם חומצת לימון במים מטוהרים של 500 מ"ל) התכוננו ביום המבחן.
טרי-נתרן ציטראט דיהידראט	סיגמא-אולדריץ'	S4641-500G
חומצת לימון	סיגמא אולדריץ'	C0759
צביעת צנצנת וסלסלה	דלתלאב	19360
		19361
שקופיות מיקרוסקופ Superfrost Plus	VWR	631-0108
תמיסת מלח Tris-Buffered (TBS) (בסיס טריזמה של 50 מילימטר; 0.8% NaCI; pH 7.6):			10xTBS (פתרון מלאי 0.5 מטר בסיס TRIZMA; 8% NaCI; pH 7.6): בסיס TRIZMA 60,57 גרם ו- NaCl 80 גרם במים מטוהרים 800 מ"ל. התאמת רמת החומציות של תמיסת המלאי באמצעות חומצה הידרוכלורית 37% והנפח הסופי לליטר אחד עם מים מטוהרים (יש לשמור 5± 3°C עד חודשיים) לדלל TBS פתרון מלאי 1/10 ביום המבחן.
בסיס טריזמה	סיגמא אולדריץ'	T6066-1 ק"ג
נתרן כלורי (NaCl)	מרק	106404
קסילן	ריאגנטים של Panreac Applied Chem ITW	251769	לא מדולל