שיטה מבוססת אימונופלואורסנציה לכימות עקה שכפול בתאים סרטניים

Abstract

מקור: Ramakrishnan, N. et al., Quantifying Replication Stress in Ovarian Cancer Cells באמצעות Immunofluorescence DNA חד-גדילי.J. Vis. Exp. (2023)

הסרטון מדגים גישה מבוססת אימונופלואורסנציה לכימות עקה שכפול בתאים סרטניים. תאים שטופלו בהידרוקסיוראה מייצרים DNA חד-גדילי, המזוהה באמצעות אימונופלואורסנציה. ספירת מוקדי הפלואורסצנטיות הירוקים מצביעה על רמת לחץ השכפול בתאים סרטניים.

Protocol

הערה: קו תאי סרטן השחלות, OVCAR3, שימש בשלבים אלה, אך פרוטוקול זה חל באופן נרחב על קווי תאים רבים אחרים, כולל אלה שמקורם במקורות שאינם שחלתיים. סכמה של הפרוטוקול מוצגת באיור 1.

1. ציפוי התאים

1. הכינו כיסויים מצופים פולי-L-ליזין.
   1. הוסיפו כיסויים בקוטר 12 מ"מ לצינור חרוטי בנפח 50 מ"ל עם תמיסת פולי-L-ליזין, והניחו על נדנדה למשך 15 דקות.
   2. שאפו את הפתרון בתרבית רקמות. שטפו את הכיסויים על ידי הוספת מים סטריליים והניחו את הצינור המכיל את הכיסויים בחזרה על הנדנדה למשך 5 דקות. חזור על שלב השטיפה שלוש פעמים.
   3. מורחים את הכיסויים המצופים על כלי סטרילי ושואבים את....

Results

איור 1: סכמת תיוג IdU.התאים פועמים עם IdU עבור שתי הכפלות אוכלוסייה. אם יש צורך בטיפול תרופתי כלשהו, הוא צריך להינתן לאחר הכפלת האוכלוסייה הראשונה בנוכחות IDU.

איור 2: השוואה של אות המוקד שהתקבל לאחר פעימה עם IdU, BrdU או CldU.תמונות מייצגות של תאים פו.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
3% פרפורמאלדהיד (PFA)	פישר סיינטיפיק	NC0179595	10 גרם סוכרוז + 100 מ"ל 10X PBS + מים כדי להפוך נפח ל 925 מ"ל. הוסף 75 מ"ל 40% מתנול ללא PFA, לערבב, ולעשות aliquots של 50 מ"ל לפני אחסון אחסון: יש לאחסן בטמפרטורה של -20°C
5-יודו-2'-דאוקסיורידין (IdU)	סיגמא אולדריץ'	I7125-5G	MW = 354.10 גרם/מול. עבור מלאי 10 mM: להמיס 3.541 מ"ג IdU ל 1 מ"ל 1 N אמוניה נוזלית
נוגדן נגד BrdU	BD Biosciences	347580	אחסון: יש לאחסן ב-4°C
נוגדן משני נגד עכבר Alexa Fluor Plus 488	תרמו סיינטיפיק	A32766	רגיש לאור - יש לשמור בחושך
אלבומין בסרום בקר (BSA)	סיגמא אולדריץ'	A7906-100G	מיוצר על ידי הוספת מסה ספציפית לנפח PBS אחסון: יש לאחסן ב-4°C
זכוכית כיסוי עגולה	מדעי מיקרוסקופ אלקטרונים	72230-01
OVCAR3	ATCC	HTB-161	מצע גדילה: RPMI בתוספת L-גלוטמין, 0.01 מ"ג / מ"ל אינסולין בקר; סרום בקר עוברי לריכוז סופי של 20% ו 1X Pen Strep אחסון: מדיה להקפאה: מדיה צמיחה + 5% DMSO ומאוחסן ב -80 °C
תמיסת פולי-ל-ליזין	סיגמא אולדריץ'	P4832-50ML	אחסון: יש לאחסן ב-4°C
התקן הרכבה ProLong Diamond Antifade עם DAPI	תרמו סיינטיפיק	P36962	אחסון: יש לאחסן ב-4°C
טריפסין-EDTA, 0.25%	ג'נסי סיינטיפיק	25-510	אחסון: יש לאחסן ב-4°C
מים, מסוננים סטריליים	סיגמא אולדריץ'	W3500-6X500ML	אחסון: יש לאחסן ב-4°C