$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
הערה: קו תאי סרטן השחלות, OVCAR3, שימש בשלבים אלה, אך פרוטוקול זה חל באופן נרחב על קווי תאים רבים אחרים, כולל אלה שמקורם במקורות שאינם שחלתיים. סכמה של הפרוטוקול מוצגת באיור 1.
1. ציפוי התאים
- הכינו כיסויים מצופים פולי-L-ליזין.
- הוסיפו כיסויים בקוטר 12 מ"מ לצינור חרוטי בנפח 50 מ"ל עם תמיסת פולי-L-ליזין, והניחו על נדנדה למשך 15 דקות.
- שאפו את הפתרון בתרבית רקמות. שטפו את הכיסויים על ידי הוספת מים סטריליים והניחו את הצינור המכיל את הכיסויים בחזרה על הנדנדה למשך 5 דקות. חזור על שלב השטיפה שלוש פעמים.
- מורחים את הכיסויים המצופים על כלי סטרילי ושואבים את שאריות המים. הניחו לכיסויים להתייבש במכסה המנוע של תרבית הרקמה למשך שעה או עד שלא נותרו טיפות מים. לאחר ייבוש, לאטום את הכלי עם parafilm, ומניחים ב 4 °C.
- הניחו מכסה אחד מצופה פולי-L-ליזין בכל באר של צלחת בת 24 בארות. השימוש בכיסויי פוליליזין הוא קריטי למניעת ניתוק התאים מהכיסויים בשלב שלפני השאיבה.
- טריפסיניזציה של תאי OVCAR3 ברגע שהם מגיעים למפגש של 70%-80%.
- כדי ליצור תבשיל תרבית בקוטר 10 ס"מ שהוא 70%-80% מתמזג, שאפו את המדיום מהצלחת ושטפו ב-5-7 מ"ל מלח חוצץ פוספט (PBS).
- שואפים את PBS, מוסיפים 1 מ"ל של 0.25% טריפסין, ומניחים את המנה באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס למשך 8-10 דקות, או עד שהתאים מתרוממים מתחתית הצלחת.
- לאסוף את התאים עם 5-10 מ"ל של בינוני ולהוסיף צינור חרוט.
- ספור את התאים באופן ידני עם hemocytometer באמצעות הליכים סטנדרטיים.
- בצע דילול של 25,000 תאים / מ"ל והוסף 1 מ"ל של התאים על כיסויי פולי-L-ליזין שהונחו בבארות של לוחות 24 בארות. עבור כל קו תאים אחר, קבע מספר כך שהתאים יהיו בערך 70%-80% נפגשים לאחר שלוש הכפלות אוכלוסייה.
- לגדל את התאים במדיום התרבית בתנאים סטנדרטיים.
2. תאים פועמים עם IdU
- כדי שהתאים יתפשטו כראוי על גבי הכיסויים, די בהכפלת אוכלוסייה אחת. לאחר הכפלת אוכלוסייה אחת, יש לפעום את התאים עם 10 מיקרומטר 5-יודו-2'-דאוקסיורידין (IdU) (ראו טבלת חומרים כיצד ליצור מחדש את IdU) עבור שתי הכפלות האוכלוסייה הבאות.
הערה: ניסינו אנלוגים שונים של תימידין, כולל bromodeoxyuridine (BrdU), 5-chloro-2′-deoxyuridine (CIdU), ו- IdU. בין שלושת האנלוגים, IdU נותן את יחס האות לרעש הטוב ביותר. תמונות השוואתיות של תאים שפועמים עם שלושת האנלוגים השונים מוצגות באיור 2. אנו ממליצים על שימוש בשתי בקרות שליליות: (i) דגימה ללא פעימות IdU, ו-(ii) בקרה ללא נוגדנים ראשוניים. אם יש צורך להעריך את היווצרות ssDNA עקב טיפול נתון, אנו ממליצים להוסיף את התרופה לאחר הסבב הראשון של הכפלת IdU.
- לאחר פעימה עם IdU עבור שתי הכפלות אוכלוסייה, לקצור את התאים להדמיה.
- החליפו את המדיום ב-0.5% PBSTx קר כקרח (PBS + 0.5% Triton X-100) על קרח למשך 5 דקות. שלב טרום מיצוי זה מסייע לשחרר חלבונים ציטופלזמיים ושאינם קשורים לכרומטין, ומשאיר חלבונים הקשורים לכרומטין. קווי תאים מסוימים יכולים להתקלף בקלות במהלך טרום מיצוי. בתרחיש כזה ניתן להשתמש במאגר CSK 0.5% (10 mM PIPES (pH 6.8), 100 mM נתרן כלורי (NaCl), 300 mM סוכרוז, 3 mM מגנזיום כלורי (MgCl2), 1 mM אתילן גליקול חומצה טטראצטית (EGTA) ו 0.5% Triton X-100).
3. קיבוע
- יש לשאוף PBSTx ולדגור במשך 15 דקות עם 3% פרפורמלדהיד (PFA) (טבלת חומרים) בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן שלוש עד ארבע שטיפות עם PBS אחד. התאים הקבועים יכולים להישמר ב 4 ° C עד צעדים נוספים.
אזהרה: PFA רעיל מאוד ומסרטן. יש להימנע ממגע עם העור, העיניים והריריות. בצעו את כל השלבים עם PFA במכסה אדים, והשליכו את החומרים כראוי.
4. חדירה וחסימה
- לאחר הקיבוע, יש לחדור לתאים באמצעות 0.5% PBSTx על קרח למשך 5 דקות. יש להשתמש בנפח מספיק כדי לכסות את כל הכיסוי (בדרך כלל בין 500 μL ל-1 מ"ל).
- שטפו את התאים שלוש עד ארבע פעמים עם 0.2% PBST (1X PBS + 0.2% Tween-20) בטמפרטורת החדר. מ"ל אחד של PBST מספיק לשטיפת כל באר. בצעו את השטיפות גב אל גב ללא כל דגירה.
- שאפו את ה-PBST וחסמו את הדגימות באמצעות אלבומין 5% בסרום בקר, BSA (טבלת חומרים) המיוצר ב-1x PBS (חיץ חוסם) למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
5. Immunostaining עם נוגדן IdU
- עבור immunostaining, להכין תא לח (מגבת נייר רטובה על Tupperware שטוח תחתית). מכסים את מכסה הצלחת בת 24 הבארות בפרפילם, מניחים בתא הלח ומניחים את הכיסויים על מכסה הצלחת.
- הכן את נוגדן העכבר הראשי נגד BrdU (טבלה של חומרים) על ידי דילול שלו 1:200 במאגר החוסם משלב 4.2. הנוגדן נגד BrdU הוכח בעבר כמזהה IdU.
- הוסף 60 μL של דילול נוגדנים IdU בחלק העליון של הכיסויים. יש לדגור על הכיסויים למשך שעה אחת בטמפרטורה של 37°C.
- לחילופין, יש להשתמש בתמיסת נוגדנים פחותה אם הופכים את הכיסויים על טיפה (20-25 מיקרוליטר) של דילול נוגדנים בקנ"מ 1:200 המודבק על פרפילם. זה גם מקטין את הסבירות של הפתרון להתייבש במהלך הדגירה.
- לאחר הדגירה של 1 שעות, שואפים את הנוגדן העיקרי. החזירו את הכיסויים לצלחת בת 24 בארות, ושטפו אותם ארבע פעמים עם 0.2% PBST.
- עבור הנוגדן המשני, השתמש באותו חדר לחות המתואר בשלב 5.1. לדלל נוגדן משני מצומד נגד עכבר (טבלה של חומרים) במאגר החוסם (1:200). יש להוסיף 60 μL של נוגדן משני לכיסויים, ולדגור בטמפרטורת החדר בחושך למשך שעה אחת.נוגדן משני זה רגיש לאור.
- לשאוף את הנוגדן המשני. החזירו את הכיסויים לצלחת בת 24 הקידוחים, ושטפו ארבע פעמים עם 0.2% PBST.
- סמן שקופיות מיקרוסקופ, והתקן את החלקות הכיסוי על השקופיות עם אמצעי הרכבה 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) (טבלה של חומרים). אחסנו מגלשות בחושך בטמפרטורת החדר למשך 24 שעות. הדגירה של 24 שעות מומלצת אם יש צורך לרפא או להתקשות את מדיום ההרכבה.
הערה: לאחר מכן ניתן לאחסן את השקופיות בטמפרטורה של 4°C לפני שהן מצולמות במיקרוסקופ פלואורסצנטי. תמונה מייצגת מוצגת באיור 3.
