$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. צימוד קוולנטי של נוגדני לכידה למיקרוספרות MagPlex
כל נוגדן לכידה מצומד למיקרוספירה מגנטית קרבוקסילית ספציפית באמצעות הליך דו-שלבי כמתואר להלן.
הערה: ערכת צימוד הכוללת את כל הריאגנטים, המאגרים והחומרים הדרושים לצימוד מיקרוספירה זמינה גם כן (ראה טבלת חומרים).
- השהה מחדש את ההשעיה של ההשעיה הלא מצומדת של המיקרוספירה בהתאם להוראות המתוארות בגיליון המידע על המוצר שסופק עם המיקרוספרות שלך.
הערה: הוראות ההשעיה יהיו תלויות בגודל ובנפח של בקבוקוני המיקרספירה .
- העבר 2.5 x 106 של מיקרוספרות מלאי לצינור מיקרוצנטריפוגה מומלץ (ראה טבלת חומרים).
- הכניסו את הצינור למפריד מגנטי ואפשרו הפרדה למשך 60 שניות.
- כאשר הצינור עדיין ממוקם במפריד המגנטי, הסר את הסופרנטנט.
הערה: היזהר לא להפריע microspheres.
- הסר את הצינור מהמפריד המגנטי והשהה מחדש את המיקרוספרות ב 100 μL של dH2O על ידי מערבולת וסוניקציה למשך 20 שניות.
- חזור על שלבים 3 ו- 4.
- הסר את הצינור מהמפריד המגנטי והשהה מחדש את המיקרוספרות שנשטפו 80 μL של 0.1 M נתרן פוספט monobasic, pH 6.2 על ידי מערבולת וסוניקציה למשך 20 שניות.
- הוסף 10 μL של 50 מ"ג / מ"ל N-hydroxysulfosuccinimide (sulfo-NHS) (מדולל ב 0.1 M נתרן פוספט monobasic, pH 6.2) למיקרוספרות ולערבב בעדינות על ידי מערבולת.
- הוסף 10 μL של 50 מ"ג / מ"ל 1-אתיל-3-[3-dimethylaminopropyl] carbodiimide hydrochloride (EDC) (מדולל ב 0.1 M נתרן פוספט monobasic, pH 6.2) למיקרוספרות ולערבב בעדינות על ידי מערבולת.
- יש לדגור במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר עם ערבוב עדין על ידי מערבולת במרווחים של 10 דקות.
- הכניסו את הצינור למפריד מגנטי ואפשרו הפרדה למשך 60 שניות.
- כאשר הצינור עדיין ממוקם במפריד המגנטי, הסר את הסופרנטנט.
הערה: היזהר לא להפריע microspheres.
- הסר את הצינור מהמפריד המגנטי והשהה מחדש את המיקרוספרות במי מלח חוצצי פוספט 250 μL (PBS), pH 7.4 על ידי מערבולת וסוניקציה למשך כ -20 שניות.
- הכניסו את הצינור למפריד מגנטי ואפשרו הפרדה למשך 60 שניות.
- כאשר הצינור עדיין ממוקם במפריד המגנטי, הסר את הסופרנטנט.
הערה: היזהר לא להפריע microspheres.
- חזור על שלבים 13-15 עבור שתי שטיפות בסך הכל.
- הסר את הצינור מהמפריד המגנטי והשהה מחדש את המיקרוספרות המופעלות והשטופות ב -100 μL של PBS, pH 7.4 על ידי מערבולת וסוניקציה למשך כ -20 שניות.
- הוסף 12.5 מיקרוגרם של נוגדן לכידה למיקרוספרות המרחפות מחדש (כלומר, 5 מיקרוגרם / מיליון מיקרוספירות).
הערה: נוגדנים חד שבטיים מועדפים ללכידה, אך ניתן להשתמש גם בנוגדנים רב-שבטיים .
הערה: 5 מיקרוגרם חלבון לכל מיליון חרוזים בדרך כלל מתפקד היטב, אך אנו ממליצים לדרג את הכמות כדי להשיג ביצועי בדיקה מיטביים.
- להביא את הנפח הכולל ל-500 מיקרוליטר עם PBS, pH 7.4.
- מערבבים תגובת צימוד על ידי מערבולת.
- דוגרים במשך שעתיים עם ערבוב על ידי סיבוב בטמפרטורת החדר בחושך.
- הכניסו את הצינור למפריד מגנטי ואפשרו הפרדה למשך 60 שניות.
- כאשר הצינור עדיין ממוקם במפריד המגנטי, הסר את supernatant.
הערה: היזהר לא להפריע microspheres.
- הסר את הצינור מהמפריד המגנטי והשהה מחדש את המיקרוספרות המצומדות ב- 1 מ"ל PBS, pH 7.4 המכיל 0.02% Tween-20, 0.1% אלבומין בסרום בקר (BSA), 0.05% נתרן אזיד (PBS-TBN) על ידי מערבולת וסוניקציה למשך 20 שניות.
- הכניסו את הצינור למפריד מגנטי ואפשרו הפרדה למשך 60 שניות.
- כאשר הצינור עדיין ממוקם במפריד המגנטי, הסר את הסופרנטנט.
הערה: היזהר לא להפריע microspheres.
- חזרו על שלבים 24-26 במשך שתי שטיפות בסך הכל.
- הסר את הצינור מהמפריד המגנטי והשהה מחדש את המיקרוספרות המצומדות ב- 500 μL של PBS-TBN.
הערה: לקבוע את מספר microspheres התאושש באמצעות מונה התא או hemocytometer.
- יש לאחסן מיקרוספרות מצומדות בקירור בטמפרטורה של 2-8°C בחושך.
הערה: פרוטוקול לאישור יעילות הצימוד זמין גם כן.
2. תיוג ביוטין של נוגדנים לזיהוי
- נוגדנים לזיהוי סומנו בביוטין באמצעות EZ-Link sulfosuccinimidyl-6-(biotinamido) hexanoate על פי הוראות היצרן עם עודף מולארי פי 20 של מגיב ביוטין כדי להשיג 4-6 קבוצות ביוטין לכל מולקולת נוגדן.
הערה: נוגדנים רב-שבטיים משמשים בדרך כלל לאיתור, אך ניתן להשתמש בנוגדנים חד-שבטיים גם אם הם ספציפיים לאפיטופ שונה מזה של נוגדן הלכידה.
הערה: לחלופין, ניתן להשתמש בנוגדנים ביוטינילציה הזמינים מסחרית לזיהוי.
3. זיהוי אורגניזמים על ידי multiplexed Capture Sandwich Immunoassay
ערכות המיקרוספירה המצומדות ונוגדני הזיהוי המסומנים שנוצרו ב-1 וב-2 לעיל משמשים בבדיקה חיסונית של סנדוויץ' לכידה מרובבת כדי לזהות ולכמת את החיידקים הקיימים בדגימה. סקירה כללית של זרימת העבודה של הבדיקה מוצגת באיור 1.
- בחר את בקבוקוני המלאי של ערכות חרוזי MagPlex מצומדות נוגדנים מאחסון של 2-8ºC.
- מערבלים וסוניקטים למשך 20 שניות.
- הכינו תערובת חרוזים מרובת חרוזים כך שכל סט חרוזים יהיה בריכוז סופי של 2500 מיקרוספרות לכל 50 מיקרוליטר עבור כל באר תגובה (50,000 חרוזים/סט/מ"ל) ב-PBS-TBN.
הערה: השתמש בגיליון אלקטרוני כדי לקבוע פרמטרי הכנה עבור תערובת חרוזי העבודה.
הערה: חרוזי בקרה פנימיים (RP1 Monitor Microspheres) עשויים להיכלל גם כדי לפקח על ביצועי הבדיקה והמכשיר.
- פיפטה 50 μL של תערובת חרוזי עבודה לתוך הבארות המתאימות של צלחת 96 בארות.
- פיפטה 50 μL של תקן או מדגם לבארות מתאימות.
- פיפטה 50 μL של PBS-TBN לכל רקע היטב.
- מכסים את הצלחת באטם נייר כסף כדי להגן על החרוזים מפני אור ודגרים על שייקר בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת עם ניעור ב-800 סל"ד.
- מניחים את הצלחת על מפריד לוחות מגנטי למשך דקה אחת.
- שומרים את הצלחת על מפריד הלוחות המגנטי, מסירים בזהירות את נייר הכסף והופכים את הצלחת כדי לרוקן את הבארות, ואז מקישים לייבוש על שכבה עבה של מגבות נייר מעבדה 3-4 פעמים.
הערה: לחלופין, שאפו ידנית את הבארות באמצעות פיפטור רב ערוצי או השתמשו במכונת כביסה אוטומטית.
- השתמש בפיפטור רב-ערוצי כדי להוסיף 200 μL של PBS-TBN לכל באר ולנער במשך דקה אחת על שייקר צלחת ב-800 סל"ד.
- מניחים את הצלחת על מפריד לוחות מגנטי למשך דקה אחת.
- שומרים את הצלחת על מפריד הלוחות המגנטי, הופכים את הצלחת כדי לרוקן את הבארות, ואז מקישים לייבוש על שכבה עבה של מגבות נייר מעבדה 3-4 פעמים.
הערה: לחלופין, שאפו ידנית את הבארות באמצעות פיפטור רב ערוצי או השתמשו במכונת כביסה אוטומטית.
- חזור על שלבים 10-12 עבור שתי שטיפות בסך הכל.
הערה: הסר מאגר רב ככל האפשר לפני שתמשיך לשלב הבא כדי למנוע דילול פוטנציאלי של התגובה.
- השתמש בפיפטור רב-ערוצי כדי להוסיף 50 μL של חיץ בדיקה לכל באר ולנער במשך דקה אחת על שייקר צלחת ב-800 סל"ד.
- דללו את נוגדן הזיהוי ביוטינילציה ל-4 מיקרוגרם/מ"ל ב-PBS-TBN.
- הוסף 50 μL של נוגדן זיהוי מדולל לכל באר.
- מכסים את הצלחת באטם נייר כסף כדי להגן על החרוזים מפני אור ודגרים על שייקר בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת עם ניעור ב-800 סל"ד.
- מניחים את הצלחת על מפריד לוחות מגנטי למשך דקה אחת.
- שומרים את הצלחת על מפריד הלוחות המגנטי, הופכים את הצלחת כדי לרוקן את הבארות, ואז מקישים לייבוש על שכבה עבה של מגבות נייר מעבדה 3-4 פעמים.
הערה: לחלופין, שאפו ידנית את הבארות באמצעות פיפטור רב ערוצי או השתמשו במכונת כביסה אוטומטית.
- יש לשטוף כל באר פעמיים בהתאם להליך המתואר בשלבים 10-12.
הערה: הסר מאגר רב ככל האפשר לפני שתמשיך לשלב הבא כדי למנוע דילול פוטנציאלי של התגובה.
- השתמש בפיפטור רב-ערוצי כדי להוסיף 50 μL של חיץ בדיקה לכל באר ולנער במשך דקה אחת על שייקר צלחת ב-800 סל"ד. סטרפטאבידין, R-פיקואריתרין מצומד (SAPE).
- דלל את כתב SAPE ל- 4 מיקרוגרם/מ"ל במאגר המבחן.
- הוסף 50 μL של SAPE מדולל לכל באר.
- מכסים את הצלחת באטם רדיד אלומיניום כדי להגן על החרוזים ועל SAPE מפני אור ודגרים על שייקר בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות עם ניעור ב-800 סל"ד.
- מניחים את הצלחת על מפריד לוחות מגנטי למשך דקה אחת.
- שומרים את הצלחת על מפריד הלוחות המגנטי, הופכים את הצלחת כדי לרוקן את הבארות, ואז מקישים לייבוש על שכבה עבה של מגבות נייר מעבדה 3-4 פעמים.
הערה: לחלופין, שאפו ידנית את הבארות באמצעות פיפטור רב ערוצי או השתמשו במכונת כביסה אוטומטית.
- יש לשטוף כל באר פעמיים בהתאם להליך המתואר בשלבים 10-12.
- יש להוסיף 100 μL של PBS-TBN לכל באר ולנער במשך דקה אחת על שייקר צלחת במהירות 800 סל"ד.
- נתח 50 μL מכל תגובה על מנתח Luminex (על פי המדריך למשתמש עבור המנתח בשימוש), איסוף מינימום של 50 חרוזים לכל חרוז להגדיר לניתוח. תיאור קצר של xMAP INTELLIFLEX® מסופק להלן.
- בחר את התפריט הנפתח בפינה השמאלית העליונה של המסך ונווט אל תצורת לוחות.
- בחר הפעל לוחית.
- בחר בסמל Eject כדי להוציא את נשא הלוחות.
- טען את הצלחת על מוביל הצלחת ובחר בסמל Repull כדי למשוך את מנשא הצלחות.
- בחר בסמל הפעלה כדי להפעיל את הצלחת.
