בניית מודל עכבר אנושי עם חסינות מהונדסת נגד HIV

Abstract

מקור: Zhen, A., et al. חסינות מהונדסת מבוססת תאי גזע מפני הידבקות ב- HIV במודל העכבר האנושי. J. Vis. Exp. (2016).

הסרטון מדגים טכניקה ליצירת מודל עכבר אנושי עם חסינות מהונדסת מבוססת תאי גזע נגד נגיף הכשל החיסוני האנושי (HIV). רקמת תימוס עוברית אנושית ותאי גזע המטופויטיים מהונדסים (HSC) מושתלים בכמוסת הכליה של עכבר מדוכא חיסון חמור. HSCs, המבטאים קולטני אנטיגן כימריים (CARs) נגד HIV, מעורבבים בתערובת חלבונים ג'לטינית המקדמת את לוקליזציה משותפת שלהם עם רקמת בלוטת התימוס. לאחר ההליך, HSCs להתמיין לתאים חיסוניים אנושיים שונים, וכתוצאה מכך לפתח מודל עכבר אנושי עם מערכת חיסון אנושית פונקציונלית נגד HIV.

Protocol

כל ההליכים הכרוכים באיסוף דגימות בוצעו בהתאם להנחיות IRB של המכון. כל ההליכים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.

1. בניית עכברים אנושיים מהונדסים עם קולטן אנטיגן כימרי CD4

1. עיבוד בלוטת התימוס העוברית ובידוד CD34+ HSCs מהכבד העוברי
   1. עיבוד בלוטת התימוס
      1. שטפו בעדינות את בלוטת התימוס במי מלח חוצצי פוספט (PBS), pH 7.4, בצינור חרוטי של 15 מ"ל. חזור על שלב הכביסה 3 - 4 פעמים.
      2. הוסף 7 מ"ל Roswell Park Memorial Institute (RPMI) מדיה + 10% סרום בקר עוברי (FBS) + פניצילין/סטרפטומיצין (Pen/strep). דקקו הכל לצלחת פטרי סטרילית בקוטר 100 מ"מ.
      3. השתמשו באזמלים כדי לחתוך את בלוטת התימוס לחתיכות קטנות של כ-1 מ"מ². הניחו כל פיסת תימוס אחת בבאר אחת על צלחת של 96 בארות. השתמשו במלקחיים קהים מעוקלים בעת העברת חתיכות בלוטת התימוס לצלחת בעלת 96 הקידוחים.
         1. הוסף כמות קטנה של מדיה (100 - 200 μl) לכל הבארות כדי שהרקמה לא תתייבש. דמיינו תחת מיקרוסקופ (לתימי יש אונות והן אמורות להיראות כמו שקי תאים).
            הערה: השליכו כל חתיכה שנראית מפוקפקת בכל דרך שהיא; לעתים קרובות יש רקמת חיבור, וזה לא צריך להיות מושתל.
      4. הסירו את חתיכות בלוטת התימוס שאושרו והכניסו את כולן לצלוחית תרבית תאי T25. הוסף 7 מ"ל RPMI מדיה בתוספת 10% FBS ו 450 מיקרוגרם / מ"ל של piperacillin/tazobactam ו amphotericin B. בעדינות בקבוק רוק לערבוב. תרבית את הבקבוק לילה ב 37 ° C / 5% CO₂.
         הערה: שלב זה נדרש כדי למנוע זיהום חיידקי של הרקמה.
      5. (שלב אופציונלי) מקפיאים את בלוטת התימוס לשימוש עתידי. אזנו את הגושים בסרום AB אנושי 90% עם 10% דימתיל סולפוקסיד (DMSO) למשך 10 דקות. מקפיאים אותם בטמפרטורה של 1ºC/min עד -50ºC, ולאחר מכן מצננים במהירות ל-150°C-. כאשר המוצר מוכן להפשרה, יש להפשיר במהירות באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס ולשטוף בעדינות 3x במדיה מלאה RPMI ללא DMSO.
   2. עיבוד כבד
      1. לשטוף בעדינות את הכבד PBS בצינור חרוטי 50 מ"ל. חזור על שלב הכביסה 3 - 4 פעמים.
      2. הוסף 10 מ"ל Dulbecco's Media של Iscove שונה (IMDM) לצינור החרוטי 50 מ"ל. דקקו הכל לצלחת פטרי סטרילית בקוטר 100 מ"מ.
      3. הומוגניזציה של רקמת הכבד באמצעות שני אזמלים. חותכים את הכבד לחתיכות קטנות של כ 3 מ"מ². גזור והשלך כל רקמת חיבור לבנה.
      4. השתמש מזרק 10 מ"ל מצויד מחט קהה 16 מד כדי לקחת את חתיכות הכבד ואת המדיה. לאחר מכן, להעביר צינור חרוטי 50 מ"ל.
      5. להשעות מחדש את התקשורת ואת השעיית רקמות ולגרש 5-7 פעמים נוספות כדי הומוגניזציה של הרקמה לחלוטין.
      6. הכינו 10 מ"ל חומר IMDM בתוספת אנזימים: 500 U/ml collagenase, 2,400 U/ml hyaluronidase, ו-300 U/ml DNase וכן 450 μg/ml piperacillin/tazobactam ו-amphotericin B. סנן את המדיה באמצעות מסנן 0.22 מיקרומטר ולאחר מכן הוסף את המדיה לתרחיף הכבד.
      7. מכסים את הצינורית החרוטית בנפח 50 מ"ל המכילה את מתלה הכבד ואוטמים היטב עם סרט אטימה עצמית כגון פרפילם למניעת דליפות. סובב במסובב צינור באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס במשך 90 דקות.
      8. סנן את תרחיף התאים המעוכל דרך מסננת תאים של 100 מיקרומטר לתוך צינור טרי של 50 מ"ל.
         הערה: הוסף PBS לתרחיף כדי להגדיל את הנפח הכולל ל -50 מ"ל. פצלו אותו לשני צינורות של 50 מ"ל, שכל אחד מהם מכיל 25 מ"ל של תרחיף תאים.
      9. הניחו לאט ובעדינות את התאים בכל צינור באמצעי צנטריפוגה בצפיפות של 10 מ"ל (למשל, Ficoll). סובב במהירות של 1,200 x גרם במשך 20 דקות ללא בלימה. הערה: כל הצנטריפוגות המוזכרות בפרוטוקול זה נעשות בטמפרטורת החדר (25 מעלות צלזיוס).
      10. הסר בזהירות את הממשק (כלומר, מעיל באפי) מכל צינור והעבר לשני צינורות נפרדים של 50 מ"ל. הבא את הנפח של כל שפופרת ממשק עד 50 מ"ל עם PBS. סחרור ב 300 x גרם במשך 7 - 10 דקות. שאפו את הסופרנאטנט בזהירות.
      11. ערבבו בין שני הכדורים. יש לשטוף שלוש פעמים נוספות עם PBS של 50 מ"ל המכיל 2% FBS. סובב ב 300 x גרם במשך 7 - 10 דקות כל אחד תוך שאיפה זהירה את supernatant.
      12. להשעות מחדש את הגלולה במדיה 50 מ"ל RPMI + 10% FBS. ספור תאים באמצעות המוציטומטר לפני שתמשיך למיון תאים.
      13. על פי פרוטוקול היצרן, מיין תאי CD34+ באופן מיידי באמצעות ערכת מיון CD34 (למשל, CD34 micro-beads).
          הערה: לחלופין, ניתן לגדל תאים בתרבית לילה במדיה RPMI + 10% FBS ב 1 מיליון / מ"ל.
      14. שמור הן CD34+ והן CD34- fractions.
          הערה: בשלב זה, ניתן להקפיא תאי CD34+ ו- CD34 באמצעות מדיית הקפאה של Bambanker או מדיה הקפאה אחרת. להקפיא 1 מ"ל של 4 - 6 x 10⁶ תאי CD34+ לכל צינור ולהקפיא 1 מ"ל של 40 - 60 x 10⁶ CD34- תאים לכל צינור.
2. התמרה של תאי CD34+
   1. חשב את מספר בארות ההולכה הדרושות לצלחת תרבית רקמה של 6 בארות. באר אחת יכולה לשמש כדי להתמיר עד 8 x 10⁶ תאים. עבור כל עכבר מח עצם/כבד/תימוס (BLT), יושתלו תאי CD34+ בגודל 0.5 x 10⁶ תאי CD34+ יחד עם תאי CD34 ובלוטת התימוס מתחת לכמוסת הכליה, ו-0.5 x 10⁶ תאי CD34+ יוזרקו לווריד. מספר תאי CD34+ לשימוש נקבע על ידי מספר העכברים (1 מיליון תאים לעכבר).
   2. יש לצפות את המספר הדרוש של בארות צלחות 6 בארות שאינן מטופלות בתרבית רקמה ב-1.25 מ"ל של תמיסת פיברונקטין אנושית רקומביננטית (למשל, רטרונקטין) (20 מק"ג/מ"ל ב-PBS) לכל באר. כסו את הצלחת ואפשרו לה לעמוד שעתיים בטמפרטורת החדר בארון בטיחות ביולוגית נקי.
   3. שאפו תמיסת פיברונקטין מבארות והוסיפו 1.25 מ"ל של חיץ מיון תאים מופעל פלואורסצנטי (FACS) (PBS עם 4% FBS) לכל באר לחסימה. הניחו לצלחת לעמוד בטמפרטורת החדר (25ºC) למשך 30 דקות.
   4. שאפו ל-FACS Buffer ושטפו בארות פעם אחת עם PBS.
   5. שמור PBS בבארות מצופות עד הצלחת מוכנה לשימוש. אחסנו את הצלחת בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה, אם לא השתמשו בה מיד.
   6. צלחת CD34+ תאים בזיהום בינוני (2% אלבומין בסרום אנושי בתווך תאי T ללא סרום של Yssel) בבארות מצופות תמיסת פיברונקטין (~ 2 x 10⁶ תאים / מ"ל) ולדגור ב 37 מעלות צלזיוס במשך 1 שעה.
   7. השתמש פיפטה כדי להוסיף וקטורים lentiviral לבארות בריבוי של זיהום (MOI) בין 2 - 10. יש לערבב ולדגור בעדינות למשך הלילה בטמפרטורה של 37ºC.
      הערה: הטיטר של וקטור הלנטיוירוס המשמש צריך להיקבע מראש.
   8. קצרו את התאים למחרת על ידי גירוד עדין של תחתית הבארות עם מגרד תאים. לאסוף תאים ולספור עם hemocytometer.
   9. כדי להכין תאים לשתל, שלב 0.5 x 10⁶ תאי CD34+ מותמרים עם 4.5 x 10⁶ CD34- תאים לכל עכבר, aliquot לתוך צינורות סטריליים 1.5 מ"ל מכסה בורג. סובבו את התאים מטה ב 300 x גרם אל הגלולה ושאפו את supernatant. סובבו אותם שוב במהירות של 300 x גרם, שאפו כל סופרנאטנט שנותר באמצעות פיפטה P10, ושאפו בזהירות רבה. שמור את הכדוריות היבשות על קרח לאורך כל המחקר. הערה: כדי להבטיח שהתאים יהיו בני קיימא, השתמש בתאים הכדוריים ובצע את הניתוח תוך 2-3 שעות.
   10. כדי להכין תאים להזרקה, סובב 0.5 x 10⁶ תאי CD34+ מומרים לכל עכבר כדי לגלול ולשאוף supernatant. השהה מחדש תאים במדיה של 100 μl RPMI לכל עכבר ושמור על קרח.
   11. כדי לבדוק את יעילות הטרנסדוקציה, aliquot ~ 1 x 10⁵ תאי CD34+ שאינם מומרים ומומרים מכל מצב ותרבית בתווך ציטוקינים 200 μl (מדיה RPMI עם 10% FBS, בתוספת 100 ng / ml אנושי IL-3, IL-6, SCF) בצלחת 96-well במשך 5 - 7 ימים ב 37 ºC.
       הערה: תאים המשמשים בשלב זה אינם משמשים לניתוח אלא כדי להבטיח שההתמרה מוצלחת והווקטור אינו רעיל להישרדות והתחדשות תאי גזע. ניתן לבדוק את יעילות הטרנסדוקציה על ידי חיפוש ביטוי גנים של הווקטור (למשל, GFP&CD4) ולנתח על ידי ציטומטריית זרימה.
3. השתלות רקמות לבניית עכברים מהונדסים גנטית
   1. באותו יום לפני הניתוח, הקרנת הגוף הכוללת של NOD מבוצעת. Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) עכברים מדוכאי חיסון עם מקרין צזיום-137 ומינון של 2.7 Gy (270Rad).
      הערה: עכברי NSG הם מדוכאי חיסון חמורים. לכן, הדיור והתחזוקה שלהם חייבים לעמוד בסטנדרטים הבריאותיים הגבוהים ביותר ולהיות מטופלים על ידי צוות מיומן מאוד.
   2. יוצקים חתיכות תימוס ובינוני מהבקבוק לצלחת בקוטר 60 מ"מ. יוצקים PBS לתוך צלחת נוספת 60 מ"מ, אשר ישמש כדי לנקות את trochar ולשמור על הכליה רטובה.
   3. מצננים קצות פיפטה עם תזוזה חיובית על ידי הנחתם בצינורות פתוחים של 1.5 מ"ל פקקי בורג סטריליים על קרח. שמור על קרח עם כדורי תאים מיובשים ותערובת חלבונים ג'לטינית כגון Matrigel.
      הערה: חשוב לשמור את תערובת החלבונים הג'לטינית ואת כל הצינורות או הקצוות שייגעו בה קרים עד להעמסת מחט השתל.
   4. הרדימו את העכברים: שקלו עכברים בנפרד ורשמו משקלים; אגרפו באוזן את העכברים כדי למספר אותם. הזריקו להם תוך צפקית 15 מיקרוליטר קטמין (2.6 מ"ג/מ"ל במי מלח)/קסילזין (100 מ"ג/מ"ל במי מלח) לגרם משקל גוף). החזירו את העכברים לכלוב וחכו שהם יהיו בהרדמה מלאה.
      הערה: בדוק את רמת ההרדמה של העכבר על ידי לחיצה על כפה. אם העכבר נרתע באופן רפלקסיבי, יש לתת 25-50% מהכמות המקורית של קטמין/קסילזין כדי להרדים את העכבר עוד יותר. המתן עד שהוא לא יירתע באופן רפלקסיבי כדי לבצע את הניתוח.
   5. בעזרת קוצץ אוסטר (מכונת גילוח), מגלחים את הצד השמאלי של כל עכבר מהירך ועד הכתף בין מרכז הגב לבטן. יש להזריק תת עורית 0.3 מ"ל של קרפרופן מדולל (6 מ"ג/ק"ג) לכתף או למשולש המפשעה של בעל החיים (בור הרגל). בעזרת צמר גפן, לשים טיפה קטנה של דמעות מלאכותיות על כל עין ולהניח את העכבר על הצד שלה בחזרה בכלוב.
      הערה: יש להגביל את ההכנה לניתוח לכלוב אחד (כ-4-5 עכברים) בכל פעם.
   6. שטפו את הצינורית של מחט השתל הסרטני (טרוקאר) בעלת 16 מד עם PBS. בעזרת זוג מלקחיים מעוקלים וקהים, מניחים חתיכת תימוס מצלחת 60 מ"מ לתוך פתח הצינורית עם הטרוקאר ממש בתוך הפתח, ואז מושכים אחורה את הטרוקאר כדי לשאוף את הרקמה לתוך הצינורית.
   7. השתמש פיפטה תזוזה חיובית וקצה צונן לשים 5 μl של תערובת חלבון קר ג'לטיני לתוך הצינור עם גלולת תאים מיובשים (CD34+ ו- CD34- תערובת עבור תאים מושתלים) ומערבבים בעדינות כדי ליצור תרחיף התא. אין לעשות פיפטה למעלה ולמטה. פיפטה תערובת חלבונים ג'לטינית / תרחיף התא לתוך פתח הצינורית ולמשוך לאט על הטרוקאר כדי לטעון את המחט.
      הערה: מומלץ להצטייד בעוזר להעמיס את פיפטה בזמן שמבצעים מניפולציות על מחט השתל.
   8. ספוג את האזור המגולח של העכבר עם פובידון-יוד ולאחר מכן לנגב את האזור עם מגבון אלכוהול שלוש פעמים. קבע את הנקודה הכהה ביותר מתחת לעור. זה מציין את המיקום של הטחול. הכליה כ-5 מ"מ גבית לטחול. הרימו את העור במלקחיים מעוקלות ובצעו חתך באורך 15 מ"מ עם מספריים כירורגיים בעור במקביל לטחול. לאחר מכן, בצע חתך דומה בשכבת הצפק שמתחת. אצל גברים, הכליה צריכה להיות גלויה בקלות וניתן לפרוש אותה פשוט על ידי לחיצה על הבטן. אתה יכול לתמוך בכליה עם hemostat או מעוקל קהה מלקחיים. אצל נקבות, השחלות נוטות לחסום את הכליה מחילוץ קל. באמצעות המוסטט, להרים את השחלה בזהירות לחשוף את הכליה.
   9. השתמש במלקחיים עם קצה המחט כדי למרוט חור זעיר בקצה האחורי של קפסולת הכליה.
      הערה: אין להשתמש במלקחיים אלה עם קצוות מחט לטיפול בחומרים מסוכנים ביולוגית.
   10. החליקו את מחט השתל לתוך חור זה ולאורך הכליה עד שפתח הצינורית מכוסה לחלוטין על ידי קפסולת הכליה.
   11. הוציאו בעדינות את הרקמה מתחת לכמוסת הכליה ומשכו את המחט חזרה החוצה. חתיכות בלוטת התימוס יכולות להיות דביקות, לכן השתמשו במלקחיים מעוקלות כדי לוודא שחתיכת בלוטת התימוס לא יוצאת עם המחט.
   12. הרימו את הצפק עם המלקחיים והשתמשו בעדינות בהמוסטאט כדי לדחוף את הכליה חזרה למקומה. קשרו תפר אחד בעל קשר כפול בצפק באמצעות 4-0 תפרים נספגים ויקריל. השתמש בשני קליפסים אוטומטיים לפצעים כדי לסגור את העור.
   13. מערבבים את תאי CD34+ המומרים שהוקצו להזרקה וסופגים 100 μl (0.5x10⁶ תאים) לתוך מזרק אינסולין. הזריקו תאים אלה לעכבר באמצעות הזרקת ורידים רטרואורביטלית או נתיבים אחרים של הזרקה תוך ורידית. בעזרת צמר גפן, לשים טיפה קטנה של דמעות מלאכותיות על כל עין ולהניח את העכבר על הצד שלה בחזרה בכלוב.
   14. לאחר שכל העכברים הושתלו, ודאו שבעלי החיים חוזרים להכרה ועושים אמבולציה כרגיל לפני שאתם עוזבים אותם.
   15. טיפול לאחר הניתוח: יש להזריק תת עורית 0.3 מ"ל של קרפרופן מדולל (6 מ"ג/ק"ג) ו-1.2 מ"ל של מי מלח סטריליים לכל עכבר ביום שלאחר הניתוח. יומיים ושלושה לאחר הניתוח, יש להזריק תת עורית 1.5 מ"ל של מי מלח סטריליים לכל עכבר. יש לעקוב אחר העכברים והחתכים במשך 10-14 ימים לאחר הניתוח. הסר את הקליפים האוטומטיים ושוקל את העכברים לאחר 10-14 ימים. הערה: עכברים הם איטיים לאחר קרינה, והזרקת מי מלח מונעת מבעלי החיים להתייבש.
   16. לאחר 8 - 10 שבועות, בדוק את ההשתלה על ידי דימום העכברים וביצוע ניתוח FACS על הדם ההיקפי, צביעה לסמנים כגון CD45, CD3, CD4, CD8, וכל הגנים שהווקטור צריך להביע.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
ערכת מיקרו-חרוזים CD34	מילטני	130-046-702	למיון תאי אב אנושיים CD34+
במבנקאי	וואקו	302-14681	להקפאת תאים
ערכת RNA ויראלי QIAamp	קיאגן	52904	למדידת עומס נגיפי בסרום
ציטומטר זרימה MACSQuant	מילטני		לניתוח זרימה
BD LSRFortessa™	BD biosciences		לניתוח זרימה
היאלורונידאז	סיגמא	H6254-500MG	לעיכול רקמות
Deoxyribonuclease I	וורטינגטון	LS002006	לעיכול רקמות
קולגנאז	טכנולוגיית חיים	17104-019	לעיכול רקמות
מערכת זיהוי PCR בזמן אמת CFX	ביוראד		למדידת עומס נגיפי וביטוי גנים
עכברים, מתח NOD. Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ	מעבדת ג'קסון	5557	לבניית העכברים שהואנשו
פניצילין סטרפטומיצין (Pen Strep)	תרמו פישר סיינטיפיק	10378016	לטיפוח תאים
פיפרצלין/טזובקטם	פייזר	זוסין	אנטי פטרייתי
אמפוטריצין B (פטרייה אנטי-מיקוטית)	תרמו פישר סיינטיפיק	15290-018	אנטי פטרייתי
AUTOCLIP תפסים לפצעים, 9 מ"מ - 1000 יחידות	בקטון דיקינסון	427631	לניתוח
שמלות כירורגיות סטריליות מחוזקות בפולי, 30 לכל מארז	מדליין	DYNJP2707	לניתוח
תפרים, 4-0, ויקריל	אוונס ומינור	23000J304H	לניתוח
תחבושות להכנת אלכוהול	אוונס ומינור	3583006818	לניתוח
כפפות, כירורגיות, 6 וחצי	אוונס ומינור	4075711102	לניתוח
T-Cell Medium ללא סרום של Yssel	מוצרי Gemini Bio	400-102	עבור CD34+ transduction
אלבומין בסרום אנושי	סיגמא-אולדריץ'	A9511	עבור CD34+ transduction