כל ההליכים הכרוכים באיסוף דגימות בוצעו בהתאם להנחיות IRB של המכון.
1. הכנת מנות מזין תאי גליה (שבועיים לפני יום התרבות)
- נתחו את קליפת המוח ממוחו של עכבר בן יום אחד לאחר הלידה וקילפו את קרומי המוח.
- קוצצים את רקמת קליפת המוח דק ככל האפשר עם מספריים נקיים בצלחת פטרי נקייה על ספסל נקי.
- מעבירים את הרקמה הקצוצה ל-12 מ"ל HBSS ומוסיפים 1.5 מ"ל של 2.5% טריפסין ו-1% (wt/vol) DNase. יש לדגור באמבט מים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות, ולהתנדנד כל 5 דקות. רקמה מעוכלת היטב הופכת דביקה ויוצרת אשכול גדול. Triturate 10-15 פעמים עם פיפטה 10 מ"ל כדי לפרק את הרקמה ולקבל עיכול טוב יותר.
- משלשלים את הרקמה המעוכלת היטב 10-15 פעמים עם פיפטה של 5 מ"ל עד שרוב הגושים נעלמים והמדיום הופך מעונן. עברו דרך מסננת תאים כדי להסיר את הגושים שנותרו והוסיפו 15 מ"ל של גליה בינונית (מדיום חיוני מינימלי (MEM) בתוספת גלוקוז (0.6% wt/vol), 10% (vol/vol) נסיוב סוסים, ופניצילין-סטרפטומיצין (1x) כדי לעצור את העיכול.
- צנטריפוגו את התאים ב 120 x גרם במשך 5 דקות ושאפו את supernatant. משעים מחדש את גלולת התא עם תווך גליה טרי וזרעים בצלחות תרבית תאים (כ 105 תאים / ס"מ2 ).
- החלף את המדיום בתווך גליה טרי למחרת כדי להסיר תאים שאינם מחוברים.
- האכילו את מנות הגליה כל 3-4 ימים עם מדיום גליה טרי. סוטרים לבקבוק 5-10 פעמים ביד כדי לעקור תאים המחוברים באופן רופף לפני שינוי המדיום.
- לאחר 10 ימים של תרבית, תאי גליה צריכים להיות כמעט נפגשים. מנתקים תאי גליה עם 0.25% טריפסין-EDTA וזורעים כ-105 תאים בצלחת תרבית תאים חדשה בקוטר 60 מ"מ. התאים הנותרים יכולים להיות מוקפאים לשימוש עתידי.
- 3 ימים לפני יום התרבית, לשנות את מדיום גליה למדיום תרבית עצבית (Neurobasal-A Medium עם 1x GlutaMAX-I ו 1x B27 תוספת)
2. תרבית נוירונים בהיפוקמפוס
הערה: כל השלבים מבוצעים בטמפרטורת החדר.
- יש לנתח 6-8 היפוקמפוסים מגורים בני יום אחד לאחר הלידה מעכברי ANK3-E22/23f/f עם מדיום HBSS בצלחת פטרי בטמפרטורת החדר. קוצצים את ההיפוקמפוס עם מספריים דיסקציה לחתיכות קטנות יותר. מעבירים היפוקמפי מצלחת הפטרי לצינור של 15 מ"ל.
- לשטוף היפוקמפי 2x עם 5 מ"ל של HBSS בצינור. השאירו את ההיפוקמפוס ב 4.5 מ"ל של 1x HBSS לאחר הכביסה.
- הוסף 0.5 מ"ל של 2.5% טריפסין לתוך 4.5 מ"ל של HBSS ודגור באמבט מים 37 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות. הפוך את הצינור כל 5 דקות. היפוקמפי מעוכל היטב צריך להיות דביק וליצור אשכול. במידת הצורך, להאריך את העיכול במשך 5 דקות נוספות.
- שטפו היפוקמפוס עם HBSS 3 פעמים במשך 5 דקות כל אחת. אין להשתמש בשואב אבק כדי להסיר את HBSS. קל מאוד להסיר את ההיפוקמפי.
- מוסיפים 2 מ"ל HBSS לאחר השטיפה ופיפטה את ההיפוקמפי למעלה ולמטה עם פיפטה פסטר 15 פעמים.
- Triturate את הרקמה עם פיפטה פסטר מלוטש אש (קוטר הפתוח מצטמצם בחצי) 10 פעמים. אל תחרוג מ-10 פעמים גם אם עדיין נותרו נתחים. גזירת יתר הורגת נוירונים.
- מניחים את הצינור במשך 5 דקות עד שכל הגושים מתייצבים בתחתית. השתמשו בעדינות בקצה פיפטה של 1 מ"ל כדי להעביר את הסופרנאטנט המכיל את הנוירונים המנותקים לצלחות ציפוי (10תאים / צלחת 60 מ"מ). מוסיפים אותו ישירות למדיום הציפוי המודגר מראש ומנערים את הצלחת בעדינות.
- חזור על שלבים 2.6-2.7 עם הגושים הנותרים עד שרוב הגושים ייעלמו.
- 2-4 שעות לאחר הזריעה, בדקו את כלי הציפוי במיקרוסקופ אור. רוב תאי העצב היו צריכים להתחבר לכיסוי. התאים המחוברים עגולים ובהירים. הופכים את הכיסויים בעזרת קצה דק מלקחיים לצלחות מזין תאי גליה עם מדיום תרבית עצבית מותנית מראש כאשר נקודות השעווה פונות כלפי מטה.
- תאי עצב יכולים לגדול בצלחות מזין תאי גליה למשך עד חודש אחד. להאכיל נוירונים כל 7 ימים עם 1 מ"ל של מדיום תרבית עצבית טרייה.
- שלב אופציונלי: שבוע לאחר הזריעה, הוסף ציטוזין ארבינוזיד (1-β-D-arabinofuranosylcytosine) לריכוז סופי של 5 מיקרומטר כדי לרסן את התפשטות גלייה.
