יצירת תרבית נוירונים ראשונית בצפיפות נמוכה מתאי עצב עובריים קפואים

תקציר

מקור: Koganezawa, N. et al., תרבית ראשונית קלה וניתנת לשחזור בצפיפות נמוכה באמצעות מלאי קפוא של נוירונים עובריים בהיפוקמפוס.J. Vis. Exp. (2023)

סרטון זה מדגים את השיטה של תרבית נוירונים עובריים שמורים בהקפאה, הכוללת הפשרה מבוקרת, דילול עם תווך נוירובזאלי וזריעה על צלחת מצופה פולי-L-ליזין. הדגירה הבאה תומכת בצמיחה ובתחזוקה של קשרים עצביים.

פרוטוקול

כל ההליכים הכרוכים באיסוף דגימות בוצעו בהתאם להנחיות IRB של המכון.

1. ציפוי צלחת

1. מצפים מיקרו-צלחת 96 בארות בפולי-L-ליזין (1 מ"ג/מ"ל, מדולל בחיץ בוראט 0.1 מ' [pH: 8.5]; 100 מיקרוליטר/באר) ודגרים למשך הלילה ב-37°C.
   הערה: רק לצפות את הבארות כי צריך להשתמש. בניסויים שבוצעו כאן, 60 הבארות האמצעיות משמשים. חיץ הבוראט מוכן על ידי ערבוב 50 מ"מ חומצה בורית ו 12 מ"מ בוראט במים מעוקרים.
2. שטפו את הצלחת פעמיים במים מעוקרים (250 מיקרוליטר/באר).
3. שטפו את הצלחת פעם אחת במדיום תרבית טרי ללא תוספים (250 מיקרוליטר/באר).
4. יבשו את הצלחת על ספסל נקי למשך 20 דקות.
5. עטפו את הצלחת ברדיד אלומיניום ושמרו אותה בטמפרטורה של 4°C עד לשימוש (תקף לחודש).

2. זריעת תאים

1. הוסיפו 50 מיקרוליטר/באר של מדיום התרבית לצלחת המצופה ושמרו אותה באינקובטור CO₂ של 37°C למשך 30 דקות עד שעה אחת. ממלאים את הבארות ההיקפיות במים מעוקרים (200 מיקרוליטר לבאר).
   הערה: מדיום התרבית מוכן על ידי הוספת 50x B-27, 400x Glutamax, ו 100 U/mL של פניצילין/סטרפטומיצין למדיום הנוירובזאלי (עיין בטבלת החומרים לקבלת פרטים).
2. הסר את תא העצב הקריוביאלי ממיכל החנקן הנוזלי. תאי העצב ששימשו כאן היו נוירונים מסוג dimethyl sulfoxide-cryopreserved (DMSO-cryopreserved).
3. יש לטבול את הקריוביאל בבלוק חום של 37°C למשך עד 3 דקות ולהפשיר חלקית את התכולה. אין לחמם את הקריוביאל במשך זמן רב מדי. העבר את התוכן לצינור 50 מ"ל ברגע שהוא מופשר.
4. העבר באיטיות את התוכן הקריוביאלי של תא העצב לצינור סטרילי של 50 מ"ל (50 μL/s) באמצעות פיפטה של 1 מ"ל עם קצה נקבוביות רחב.
5. שוטפים את הקריוביאל הריק עם 1 מ"ל של מדיום התרבית (טמפרטורת החדר; כט). העבר 1 מ"ל זה של מדיום התרבית מהטיפה הקריוביאלית (50 μL/s) לצינור 50 מ"ל המכיל את תרחיף התא.
6. הוסף 9 מ"ל של מדיום התרבית (RT) לצינור 50 מ"ל טיפה (0.5 מ"ל לשנייה) והשלם את הנפח ל -11 מ"ל. אין לחזור על הפיפטינג אלא לערבב את מתלה התא באיטיות.
7. ספירת מספר התא (השתמש במונה תאים או בהמוציטומטר).
8. מעבירים את כל תרחיף התא למאגר ומחלקים את תרחיף התא לצלחת 96 בארות באמצעות פיפטה רב ערוצית עם קצוות רחבים לנקבוביות (1.0 x 10,⁴ תאים/באר). כדי להפחית את אידוי אמצעי התרבית, מלא את הבארות ההיקפיות במים מעוקרים (שלב 2.1).
   הערה: מחקר זה מאשר כי אידוי מדיום התרבית הוא קטן עבור תרבית של 3 שבועות ללא חילופי בינוני. שיעור ההפחתה של התווך הוא 3.6% (n = 120 בארות). לפיכך, שינוי האוסמוליות לא יהיה דרסטי במהלך תקופת הדגירה בת 3 השבועות.
9. לדגור את הנוירונים במשך 1-2 שעות ב 37 ° C, 5% CO₂ אינקובטור.
10. החליפו את מדיום התרבית ב-100 מיקרוליטר מדיום תרבית שחומם מראש (37°C) לבאר והחזירו אותו לחממה של 37°C, 5% CO₂ (לא נדרש שינוי בינוני במהלך התרבית).

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
96 צלחת באר	תאגיד זאון		מוכשר
96 צלחת באר	גריינר	655986
B-27	גיבקו	17504-044	2 v/v% עבור לוחות MEA; פי 50 עבור לוחות רגילים
בורקס	סיגמא	B-9876	ריכוז סופי 12 mM
חומצה בורית	וואקו	021-02195	ריכוז סופי 50 mM
אלבומין בסרום בקר	מיליפור	12659-100 גרם	ריכוז סופי: 3% ב-PBS
גלוטמקס	גיבקו	35050-061	2.5 mM עבור לוחות MEA; 400x עבור לוחות רגילים
ב Cell Analyzer 2200	ציטיבה		תמונות פלואורסצנטיות
נוירובזל	גיבקו	21103-049
פניצילין/סטרפטומיצין	גיבקו	15140-122	100 U / מ"ל עבור צלחות רגילות
פניצילין/סטרפטומיצין	נאקלאי טסק	26253-84	100 מיקרוגרם/מ"ל עבור צלחות MEA
פולי-ל-ליזין	סיגמא	P2636	מדולל בחיץ הבוראט (ריכוז סופי: 1 מ"ג/מ"ל)
סקיי נוירון	AlzMed, Inc.	ARH001	1.0 x 106 תאים/צינור