כל ההליכים הכרוכים באיסוף דגימות בוצעו בהתאם להנחיות IRB של המכון.
1. ציפוי זכוכית כיסויים עם פולי-L-ליזין
- הכינו כיסויי זכוכית על ידי הפשרת אליציטוט 5 מ"ל של 200 מיקרוגרם/מ"ל תמיסת פולי-ל-ליזין (PLL). דללו תמיסת מלאי זו ל-20 מיקרוגרם/מ"ל על ידי הוספת 45 מ"ל מים טהורים באיכות הזרקה. סנן-לעקר את התמיסה לתוך צינור חרוטי חדש 50 מ"ל. תייג צינור זה כ"PLL סטרילי".
הערה: השתמשו במים המאוחסנים בטמפרטורת החדר כדי להאיץ את תהליך ההפשרה.
- הוסף 100 כיסויי זכוכית סטריליים, עגולים, 12 מ"מ לתמיסת PLL הסטרילית. יש להסעיר את הצינור כל 5-10 דקות, למשך 2-3 דקות, כדי להבטיח ציפוי אחיד. מצפים את הכיסויים בדרך זו למשך 1 שעות
הערה: כיסויי זכוכית עגולים מתוצרת גרמניה (קוטר = 12 מ"מ) עדיפים, מכיוון שהם מספקים משטח תרבית אמין ומתאימים בקלות לבארות של צלחת תרבית תאים בת 24 בארות.
- לאחר 40 דקות של ציפוי PLL, קחו 2 חתיכות נייר טישו והניחו אותן שטוחות בארון הזרימה. יש לעקר את הנייר באמצעות 70% אתנול, ולאחר מכן לשטח כדי להסיר קמטים ולהשאיר לייבוש.
- לאחר ציפוי כיסויי הזכוכית למשך שעה אחת עם PLL, יש להסיר תמיסת PLL עודפת ולהוסיף מים סטריליים בדרגת הזרקה. יש להסעיר בעדינות את הכיסויים למשך 2-3 שניות כדי לאפשר הסרת עודפי PLL. חזור על שלב שטיפה זה פעמיים נוספות.
- הסר את עודפי המים, ולאחר מכן להעביר את הכיסויים לנייר הטישו הסטרילי. יש להפריד בזהירות כל כיסוי באמצעות מלקחיים מעוקלים ולהשאיר לייבוש.
הערה: כיסויים שאינם נפרדים בקלות ניתן להשליך. לחלופין, ניתן להוסיף כמות קטנה של מים כדי לסייע בהפרדה.
- לאחר הייבוש, העבירו את הכיסויים לצלחת תרבית בת 24 בארות.
הערה: יש להכין את הכיסויים כ-30 דקות-שעה לפני תחילת תהליך הדיסקציה. ניתן לאחסן צלחות באינקובטור בטמפרטורה של 37°C ו-5% CO2 עד לצורך.
2. דיסוציאציה של רקמת ההיפוקמפוס וקליפת המוח
- הכנת פתרונות תרבית תאים
- עבור דיסוציאציה של רקמה עצבית, תחילה להפשיר 40 מ"ל aliquot של חיץ תרבית תאים (הרכב [ב mM]: 116 NaCl, 5.4 KCl, 26 NaHCO3, 1.3 NaH2PO4, 1 MgSO4·7H2O, 1 CaCl2·2H2O, 0.5 EDTA·2Na·2H2O ו 25 D-גלוקוז, pH = 7.4). למדוד החוצה 12 מ"ל של חיץ תרבית תאים לצינור חרוטי 15 מ"ל; תווית כ- "BSA". למדוד 5 מ"ל של חיץ תרבית תאים לצינור אחר של 15 מ"ל; תווית כמו "papain". לדגור על שני צינורות באמבט מים במשך 15 דקות ב 37 ° C.
- יש לסנן-לעקר את מאגר תרביות התאים שנותר, לסמן כ"חיץ - סטרילי" ולאחסן בטמפרטורה של 4°C עד לצורך.
- שקלו 120 מ"ג אלבומין בסרום בקר (BSA) והוסיפו לצינור שכותרתו "BSA". שוקלים 7 מ"ג פפאין ומוסיפים לצינור שכותרתו "פפאין". החזירו את שני הצינורות לאמבט המים למשך 15 דקות
הערה: כדאי להוסיף כמות קטנה של חיץ לסירת השקילה כדי להקל על העברת אבקת הפפאין.
- לאחר שכל האבקות התמוססו, יש לעקר כל תמיסה לצינור חרוטי טרי בנפח 15 מ"ל. עבור פפאין צינור, תייגו את התמיסה המסוננת כ"פפאין - סטרילי". עבור צינור BSA, חלק את תמיסת BSA סטרילית ל -3 צינורות, שכל אחד מהם מכיל 4 מ"ל של תמיסת BSA. תייגו כל צינור כ-"BSA - סטרילי" ו-"1", "2" או "3". החזירו את כל הצינורות לאמבט המים והמשיכו לדגור בטמפרטורה של 37°C עד לצורך.
- הכנה לדיסקציה של רקמות
- קח חתיכה אחת של נייר מסנן 35 מ"מ (ראה טבלת חומרים) ולעקר עם אתנול 70%; להשאיר לייבוש במכסה של צלחת פטרי 100 מ"מ, בארון זרימה. הניחו את המספריים, המלקחיים, האזמל והמרית (ראו טבלת חומרים) הדרושים לנתיחת ההיפוקמפוס וקליפת המוח.
- הניחו שתי צלחות פטרי 35 מ"מ וצלחת פטרי 100 מ"מ המכילה נייר סינון סטרילי במקום נגיש במרכז ארון הזרימה.
- לאסוף NexCre מהונדס; גורי עכברי Ai9 ו-VGAT ונוס שיש לנתח. השתמש במנורת פלורסנט עם מסנני עירור ופליטה מתאימים (ראה טבלת חומרים) כדי להבחין בין גורי פלורסנט לבין חברי המלטה מסוג בר.
- מיד לפני ניתוח בעלי חיים, מלאו כל צלחת פטרי בקוטר 35 מ"מ במאגר תרבית תאים צונן וסטרילי.
הערה: צלחת פטרי אחת מיועדת לניקוי הכלים בין נתיחות, והשנייה מיועדת לאיסוף ההיפוקמפוס וקליפת המוח.
- דיסקציה של רקמות
- ברגע ששופכים את חיץ תרבית התא, ערפו את ראשו של עכבר מהונדס או גור חולדות מהונדס 0-2 לאחר הלידה באמצעות מספריים גדולים וחדים והשתמשו בצלחת פטרי סטרילית בקוטר 100 מ"מ כדי להעביר את הראש לארון הזרימה. השתמש במלקחיים, מספריים ומרית כדי להעביר בזהירות את מוחו של גור מהונדס לנייר סינון סטרילי.
- השתמש באזמל מסוג 22 כדי לנתח את המוח הקטן ולהפריד בין 2 חצאי הכדור. השתמש במרית קטנה כדי לגלגל את ההמיספרות לרוחב. בכל חצי כדור, לחץ בעדינות כלפי מטה כך שקליפת המוח תבוא במגע עם נייר המסנן. הזיזו בעדינות אזורים במוח התיכון כדי לחשוף את ההיפוקמפוס וקליפת המוח.
הערה: היזהר לא להפעיל לחץ רב מדי כאשר לוחצים על ההמיספרות או תאים יכולים להימחץ.
- השתמש באזמל או במרית כדי להפריד את ההיפוקמפוס וקליפת המוח מכל חצי כדור. מעבירים רקמה מנותחת לצלחת פטרי 35 מ"מ המכילה חיץ תרבית תאים צונן.
הערה: אם מנתחים מספר בעלי חיים, אחסנו את מאגר תרבית התאים הסטריליים בצינור חרוטי של 50 מ"ל על קרח. לאחר כל דיסקציה, העבירו את הרקמה המנותחת למאגר תרבית התאים המצונן.
- לאחר דיסקציה מוצלחת של רקמת קורטיקו-היפוקמפוס, להעביר את פתרון פפאין סטרילי מן אמבט המים אל ארון הזרימה. השתמשו בפיפטת פסטר 3 מ"ל כדי להעביר את ההיפוקמפוס וקליפת המוח המנותחים למכסה של צלחת פטרי סטרילית בקוטר 35 מ"מ. קוצצים בתנועה צולבת, באמצעות החלק השטוח של אזמל מסוג 22, עד שהרקמה נמצאת בחתיכות קטנות.
- השתמש כמות קטנה של תמיסת פפאין כדי להעביר את הרקמה קצוצה מן המכסה של צלחת פטרי אל צינור פפאין סטרילי. להחזיר את צינור פפאין לאמבט המים לדגור את הרקמה ב 37 ° C במשך 25 דקות.
- במהלך הדגירה של פפאין, מהווים תמיסת מדיה פלואורסצנטית מלאה. להפשיר aliquot 1 מ"ל של B27, aliquot 0.5 מ"ל של Glutamax ו 0.5 מ"ל aliquot של Pen-Strep. Aliquot 48.5 מ"ל של תרדמה מדיה פלואורסצנטית נמוכה לצינור חרוטי 50 מ"ל. הוסף B27, Glutamax ו- Pen-Strep לתמיסה. נערו היטב את התמיסה ולאחר מכן סננו ועיקרו ותייגו כ"מצב שינה מדיה שלם" (עם תאריך וראשי תיבות). לדגור ב 37 °C (77 °F) באמבט מים.
- לאחר הדגירה של פפאין, מעבירים את צינור הפפאין ואת צינורות ה- BSA הסטריליים לארון הזרימה. השתמש פיפטה פסטר 1 מ"ל כדי להסיר רק את רקמת קורטיקו-היפוקמפוס מצינור פפאין לתוך BSA-tube 1.
הערה: דאג למזער את העברת עודף תמיסת פפאין.
- דיסוציאציה של תאים
- על מנת לשבור כל גושים גדולים של רקמה, triturate את הרקמה מספר פעמים באמצעות פיפטה 1 מ"ל פסטר. לאחר מכן, triturate את הרקמה 7 פעמים באמצעות פיפטה פסטר קצה דק. השאירו את הרקמה לעמוד במשך 30 שניות, ואפשרו לחתיכות גדולות יותר של רקמה לשקוע.
- לאחר 30 שניות, להעביר את התחתון 1 מ"ל של תמיסה ורקמה מ BSA-tube 1 ל BSA-tube 2. Triturate את הרקמה ב BSA-tube 2 מספר פעמים באמצעות פיפטה פסטר קצה דק.
- לאחר טריטורציה, להעביר שוב את התחתון 1 מ"ל של רקמה ותמיסה מ BSA-צינור 1, אבל עכשיו BSA-צינור 3. שלשו את הרקמה בצינור BSA-3 מספר פעמים באמצעות פיפטה עדינה של פסטר.
- לאחר הטריטורציה, להעביר את כל התמיסה והרקמה מצינורות 2 ו -3 לתוך BSA-tube 1. משלשלים עוד 2-3 פעמים וצנטריפוגה ב-3,000 x גרם למשך 3 דקות.
- במהלך הצנטריפוגה, מרכיבים מדיה שלמה של Neural Basal A (מדיה NBA). Aliquot 48.5 מ"ל של מדיה NBA לצינור חרוטי 50 מ"ל ולדגור ב 37 ° C באמבט מים. תייגו את הצינור הזה כ"NBA בלבד". בנוסף, להפשיר aliquot 1 מ"ל של B27, aliquot 0.5 מ"ל של Glutamax ו 0.5 מ"ל aliquot של Pen-Strep בטמפרטורת החדר.
- לאחר הצנטריפוגה, בזהירות להסיר את supernatant מן הרקמה pelleted ו להשעות מחדש את התאים ב 2 מ"ל של מדיה מלאה. השתמש פיפטה P1000 כדי triturate את הרקמה למעלה ולמטה 20 פעמים.
הערה: היזהר לא pipette את התאים במרץ מדי. אם מופעל לחץ רב מדי, התאים עלולים להיפגע.
- השתמש פיפטה פסטר 1 מ"ל כדי לסנן את תרחיף התא דרך מסננת תא 30 מיקרומטר לתוך צינור דגימת פוליסטירן.
הערה: אם מתלה התא אינו עובר מיד דרך מסננת התא, ייתכן שיהיה צורך ללחוץ על גבי המסננת עם כפפה סטרילית כדי להתחיל את הזרימה. שלב חשוב זה מונע סתימה של סדרן התא.
- לאיסוף נוירונים לאחר המיון, להכין צינורות איסוף על ידי pipeting 300 μL של מדיה שלמה למספר הנדרש של צינורות פוליפרופילן.
- מתלה התאים מוכן כעת להילקח למיון התאים למיון. קח את השעיית התא, צינורות איסוף נוספים וחוסך מדיה מלאה במקרה דילול של הדגימה נדרש.
3. מיון תאים של נוירונים מטוהרים GABAergic או Glutamatergic
הערה: כדי למזער את הסיכוי לזיהום חיידקי במהלך המיון, שטפו את צינורית הדגימה של הממיין באתנול 70% לפחות 5 דקות לפני המיון. פרמטרי מיון מפורטים משתנים בין מכשירים, שיקולים בסיסיים הם כדלקמן.
- במהלך מיון התאים הראשון, קבעו רמות של פלואורסצנטיות רקע מתאים לא מסומנים על ידי מיון והשוואה של תאים מחיית בר.
- כדי שכל סוג תא פלואורסצנטי ימוין, בחר את מסנני העירור והפליטה המתאימים. לעורר חלבונים Venus ו- TdTomato באמצעות אורכי גל עירור 488 ננומטר או 531 ננומטר, בהתאמה. זהה אור הנפלט באמצעות ערכות מסנני פליטה 530/40 ו- 575/30, בהתאמה.
- הוסף צינורות איסוף פוליפרופילן, המכילים 300 μL של מדיה שלמה, לממיין התאים לאיסוף תאים.
- לטוהר גבוה, מיין תאים פלואורסצנטיים המסומנים בבהירות (ראו איור 1B לדוגמה חלקות נקודות של תאים ממוינים).
- לאחר המיון, לקבלת תוצאות מיטביות, בצע בדיקת טוהר של התאים הממוינים כדי להעריך את רמות הטוהר. שימו לב ששיעור השחזור האופייני של תאים לאחר מיון הוא בין 70-80%.
- רשום לעצמך את מספר התאים הממוינים בכל שפופרת איסוף. ערך זה ניתן על ידי מכשיר מיון התא.
הערה: מיון תאים יכול להתבצע באמצעות זרבובית 70 מיקרומטר (לחץ נוזל נדן 70 psi) או זרבובית 100 מיקרומטר (לחץ נוזל נדן 20 psi).
4. תרבית של נוירונים ממוינים
- לאחר מיון התאים, מעבירים תאים שנאספו לצינורות צנטריפוגות תחתונות עגולות בנפח 2 מ"ל, באמצעות פיפטה של פסטר בנפח 1 מ"ל. צנטריפוגה את התאים ב 3,000 x גרם במשך 3 דקות כדי ליצור כדור התא.
הערה: כדי לסייע בזיהוי המיקום של כדורית התא, כוונו את צינורות הצנטריפוגות התחתונות העגולות כאשר ציר המכסה פונה כלפי חוץ, מה שמאפשר לכדורית התא להיווצר על גב צינור הצנטריפוגה (כלומר, באותו צד של הצינור כמו הציר).
- במהלך הצנטריפוגה, הוסף 1 מ"ל של B27, 0.5 מ"ל של גלוטמקס ו 0.5 מ"ל של Pen-Strep ל 48.5 מ"ל של מדיה NBA שחוממה מראש. נערו היטב את הפתרון, ואז סננו אותו, עקרו אותו ותייגו אותו כ"מדיה מלאה ב-NBA" (עם תאריך וראשי תיבות). יש להחזיר לאמבט מים עד לצורך.
- לאחר הצנטריפוגה, השתמש בפיפטת פסטר 1 מ"ל כדי להעביר את הסופרנאטנט לצינור צנטריפוגה אחר (שמור על הסופרנאטנט במקרה שכדור התא הופרע). השהה מחדש את גלולת התא בכמות הנדרשת של מדיית NBA שלמה שחוממה מראש כדי להשיג צפיפות תאים של 1,000 תאים/μL. השעה מחדש את התאים על ידי פיפטציה למעלה ולמטה עם פיפטה P200 או P1000.
- כדי לאשר את נוכחותם של תאים מנותקים, בדוק את תמיסת התא תחת מיקרוסקופ, באמצעות עדשה אובייקטיבית 4x או 10x. לחילופין, יש להעביר כמות קטנה של תמיסת תאים על גבי כיסוי ולבדוק מתחת למיקרוסקופ. אם קיימים מספר גדול של תאים, ניתן להיפטר מהסופרנאטנט משלב 4.3.
- לפני ציפוי התאים, מערבלים במהירות בינונית למשך 2-3 שניות כדי להבטיח השעיה אחידה של התא. לאחר מערבולת, פיפטה במהירות 10 μL של תרחיף התא למרכז כל כיסוי. לאחר צנרת התאים, להחזיר במהירות כל צלחת לאינקובטור (5% CO2/37 ° C) ולדגור במשך 1 h.
הערה: אם אתם מוסיפים תאים למספר לוחות של 24 בארות, ודאו צפיפות תאים אחידה על ידי ערבול תאים בין הלוחות.
- לאחר שעה אחת, הזינו את התאים ב-500 מיקרוליטר של מדיית NBA מלאה שחוממה מראש וחזרו לאינקובטור.
הערה: כאשר מזינים את התאים, חשוב pipete את התקשורת בעדינות במורד הצד של הבאר כדי למנוע ניתוק התא. עבור ניסויים קצרים (<16 ימים), הזנה בצפיפות הנ"ל אינה הכרחית. בעת ציפוי צפיפות גדולה יותר של תאים, ייתכן שיהיה צורך במרווחי הזנה תכופים יותר.
