יצירת אבות עצביים מתאי גזע עובריים בתרביות חד-שכבתיות נטולות סרום

תקציר

מקור: Wongpaiboonwattana, W., et al. התמיינות עצבית של תאי גזע עובריים של עכבר בתרבית חד-שכבתית נטולת סרום. J. Vis. Exp.(2015)

הסרטון מדגים פרוטוקול המשתמש במדיה נטולת סרום כדי ליצור אבות עצביים מתאי גזע עובריים של עכברים. הריכוז הרצוי של תאי גזע עובריים, המרחפים במדיה נטולת סרום, מצופה על כיסויים מצופים ג'לטין. בצפיפות תאים אופטימלית, תאים מייצרים גורמי איתות אוטוקריניים, אשר, יחד עם הגורמים מעוררי התמיינות עצבית במדיה נטולת הסרום, מפעילים את התמיינות תאי גזע עובריים לאבות עצביים.

פרוטוקול

1. הכנת מדיה

הערה: הפרוטוקול מסתמך על שימוש בשילוב של שתי מדיות נפרדות: DMEM/F12 בתוספת תוסף N2 שונה ונוירובזל בתוספת B27, בדרך כלל ביחס של 1:1.

1. הכן את תוספת N2 שונה על ידי ערבוב הרכיבים בצינור 15 מ"ל. אין לערבל או לסנן זאת; מערבבים על ידי היפוך הצינור עד שהתמיסה ברורה.
   1. התחל על ידי pipetting 7.2 מ"ל של DMEM/F12, ולאחר מכן להוסיף 1 מ"ל של 25 מ"ג / מ"ל אינסולין (מורכב 0.01 M HCl) ולערבב היטב על ידי היפוך הצינור. לוקח כמה דקות עד שהפתרון ברור.
   2. הוסף 1 מ"ל של 100 מ"ג / מ"ל apo-transferrin (מורכב במים), 33 μl של 0.6 מ"ג / מ"ל פרוגסטרנון (מורכב אתנול), 100 μl של 160 מ"ג / מ"ל (1 M) putrescine (מורכב במים), 10 μl של 3 mM נתרן סלניט (מורכב במים) ו 666 μl של 7.5% אלבומין בסרום בקר ומערבבים את הצינור היטב. Aliquot לתוך 2.5 מ"ל ולאחסן ב -20 ° C עד 2 חודשים.
2. הכינו את התקשורת.
   1. כדי 250 מ"ל של DMEM/F12 להוסיף 2.5 מ"ל של N2. מערבבים היטב אך לא מנערים או מסננים.
   2. כדי 250 מ"ל של מדיה נוירובזלית, להוסיף 5 מ"ל של תוספת B27. מערבבים היטב אך לא מנערים או מסננים.
   3. ערבב את המדיה משלבים 1.2.1 ו- 1.2.2 ביחס של 1:1. במקרים מסוימים ייתכן שיהיה צורך בתערובת של 1:3 (בתוספת תערובת 1:1 בשלב 1.2.4).
   4. לתערובת מוסיפים 0.5 מ"ל של L-גלוטמין (ריכוז סופי 0.2 mM) ו 3.5 μl של 2-mercaptoethanol (ריכוז סופי 0.1 mM) ומערבבים היטב ללא רעידות. אחסנו את המדיה בטמפרטורה של 4°C למשך עד 3 שבועות והימנעו מחשיפה לאור. התמהיל הסופי הזה נקרא N2B27.
3. הכינו את תמיסת הג'לטין.
   1. הכינו תמיסת ג'לטין 1% במים טהורים במיוחד ואוטוקלאבה בטמפרטורה של 121°C, 15 psi, למשך 15 דקות. חשוב שהבקבוק המשמש לכך יהיה נקי לחלוטין מדטרגנטים או חומרי חיטוי, ולכן מומלץ להשתמש בבקבוק חדש לשם כך ולשטוף אותו רק במים אולטרה טהורים בין השימושים. Aliquot תמיסה 1% לתוך 50 מ"ל aliquots ולשמור על 4 ° C במשך חודשים.
   2. יש לחמם אליקוט של 1% ג'לטין באמבט מים בטמפרטורה של 37°C עד להמסה ולהוסיף ל-500 מ"ל של מלח חם חוצץ פוספט (PBS). מערבבים היטב ומזלפים מספיק כדי לכסות את החלק התחתון של כל באר או צלחת. הניחו לג'לטין לצפות את פני השטח למשך 30 דקות לפחות.

2. ציפוי התאים

הערה: פרוטוקול זה חל באותה מידה על ESC עכבר שגדל בסרום 10% עם גורם מעכב לוקמיה (LIF), תחליף סרום עם LIF או מדיה נטולת סרום עם LIF וחלבון מורפוגנטי עצם 4 (BMP4) או מעכבי MEK ו-GSK3 (מדיה 2i) עם או בלי LIF. עם זאת, העיתוי והיעילות של ההתמיינות עשויים להשתנות בהתאם למדיה ולתאים. עבור הניסויים המוצגים כאן השתמשנו בקו ESC עכבר 46C (עם כתב EGFP דפק לתוך אחד האללים האנדוגניים Sox1), גדל GMEM עם 10% סרום ו- LIF. לקבלת תוצאות מיטביות, חשוב שהתאים יהיו מנותקים ומצופים מחדש במדיה N2B27; שינוי פשוט של מדיה מ- GMEM/סרום/LIF ל- N2B27 תמיד מביא ליעילות התמיינות מופחתת בהשוואה לציפוי מחדש של התאים.

1. לגדל את התאים GMEM עם 10% סרום, 1 mM נתרן פירובט, 1x חומצות אמינו לא חיוניות, 0.1 M 2-mercaptoethanol, ו 100 יחידות / מ"ל LIF13. כדי לקבל תרבית תת-מפגש של ESC עכבר, צלחת 1 x 10⁶ תאים לתוך בקבוק תרבית T25 אשר ייקח 2 - 3 ימים.
2. התבוננו בתאים תחת מיקרוסקופ שדה בהיר. כאשר התאים תת-חופפים ומוכנים למעבר, שטפו אותם פעמיים ב-PBS. מוסיפים 1 מ"ל של מגיב דיסוציאציה של תאים ומחזירים לאינקובטור למשך 2 - 5 דקות. למרות שטריפסין ואנזימים אחרים יכולים לשמש גם לדיסוציאציה של תאים, הם יכולים להשפיע לרעה על התקשרות התא, ולכן יהיה צורך להתאים את צפיפות הציפוי.
3. ברגע שהתאים מתחילים להתרומם מהצלחת, הקש על הכלי כדי לעקור אותם לתרחיף תא יחיד. לאסוף את התאים לתוך 10 מ"ל של מדיה ודיסוציאציה תאים מגיב ו pipet לתוך צינור צנטריפוגה 15 מ"ל.
4. סובב את התאים במהירות של 300 x גרם למשך 3 דקות ב- RT.
5. בזהירות לשאוף את supernatant ו resuspend את הגלולה ב 10 מ"ל של N2B27 שחומם מראש על ידי pipeting למעלה ולמטה 3 - 5 פעמים. כאשר מפעילים את המתלה כלפי מטה, מצמידים את הצינור לצד הצינור כדי למנוע יצירת בועות. ספור את התאים עם מונה תאים אוטומטי או hemocytometer ולרשום את הריכוז.
6. הכינו תרחיף תא המכיל את מספר התאים הרצוי ליחידת נפח לציפוי לכל באר ב-N2B27 שחומם מראש. צפיפות של 10,500 תאים לסמ"ר² בצלחת של 6 בארות (כלומר, 1 x 10⁵ תאים לכל באר של צלחת 6 בארות) היא אופטימלית. ראה טבלה 1 למספר התאים המוצע לסמ"ר² ונפחי ציפוי מדיה לכלי תרבית תאים שונים.
7. שאפו את הג'לטין מכלי התרבית ופלטו את תרחיף התא בהתאם לצפיפות ולנפח המוצעים בטבלה 1. אין לערבל את הצלחות, שכן זה ירכז את התאים למרכז. מקם את התרביות באינקובטור לח ב 37 °C (77 °F), 5% CO₂.
8. שנה מדיה כל 1 - 2 ימים על ידי החלפת כל המדיה עם N2B27 טרי. פיפטה בעדינות כמו שטיפת התאים עלולה להשפיע על הצפיפות ולהפחית את יעילות ההתמיינות בימים הבאים. כאשר הכדאיות הראשונית לאחר הציפוי גרועה, יש לצלחת את התאים בתערובת של 1:3 של המדיה בתוספת N2 ו-B27 ולשנות זאת ל-N2B27 לאחר היומיים הראשונים. התאים יתחילו להתמיין ואמורים להראות ביטוי Sox1 (הנראה על ידי פלואורסצנטיות ירוקה של המדווח בקו התאים 46C המשמש כאן) תוך 4 - 6 ימים.

טבלה 1. צפיפויות ציפוי מומלצות ונפחי מדיה עבור גדלים שונים של כלי שיט. צפיפות הציפוי בטבלה זו נקבעה באמצעות קו התאים 46C. לקבלת תוצאות מיטביות, ייתכן שיהיה צורך להתאים את צפיפות הציפוי של כל קו בנפרד.

פלטפורמה	טווח צפיפות אפקטיבית (תאים/ס"מ2)	טווח מספר תא ללוחית	נפח מדיה ראשוני מומלץ (μl)	נפח מדיה מומלץ לאחר היום הראשון (μl)
צלחת 6 בארות	10,500 - 36,500	99,750 - 346,750	1,000	2,000
צלחת 24 בארות	15,600 - 46,800	29,640 - 88,920	500	1,000
צלחת 96 באר	103,500 - 260,000	33,120 - 83,200	100	200

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
סרום בקר עוברי	לייף טכנולוגיות	10270-106
DMEM/F12	לייף טכנולוגיות	11320-074
מדיום נוירובזאלי	לייף טכנולוגיות	21103-049
מגיב דיסוציאציה של תאי StemPro Accutase	לייף טכנולוגיות	A11105-01
תוסף B-27, ללא סרום	לייף טכנולוגיות	17504-044
אינסולין	סיגמא	I6634	לבנות מחדש עם 0.01M HCl סטרילי
אפו-טרנספרין	סיגמא	T1147	לשקם עם מים סטריליים
פרוגסטרון	סיגמא	P8783	בנייה מחדש עם אתנול
פוטרסין	סיגמא	P5780	לשקם עם מים סטריליים
נתרן סלניט	סיגמא	S5261	לשקם עם מים סטריליים
שבר אלבומין בקר V	לייף טכנולוגיות	15260-037
ל-גלוטמין	לייף טכנולוגיות	25030-081	יש לוודא שהוא מומס לחלוטין לפני השימוש, שכן גלוטמין בדרך כלל משקע
ג'לטין	סיגמא	G1890
צלחת תרבית רקמות 6 בארות	תרמו סיינטיפיק	140675
צלחת תרבית רקמות 24 בארות	תרמו סיינטיפיק	142475
צלחת תרבית רקמות 96 בארות	תרמו סיינטיפיק	167008
GMEM	לייף טכנולוגיות	11710-035
סרום בקר עוברי	לייף טכנולוגיות	10270-106
MEM תמיסת חומצות אמינו לא חיוניות	לייף טכנולוגיות	11140-050
נתרן פירובט	לייף טכנולוגיות	11360-070
2-מרקפטואתנול	סיגמא	M7522
בקבוק תרבית רקמה 25 סמ"ר	תרמו סיינטיפיק	156367