מאמר שיטה

התמיינות תאי גזע עצביים אנושיים לתרבית תלת-ממדית באמצעות פיגום נקבובי

8 ביולי 2025

במאמר זה

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מקור: Stevanato, L. et al., התמיינות של קו תאי גזע עצביים אנושיים על תרביות תלת מימדיות, ניתוח של microRNA וגנים מטרה משוערת. J. Vis. Exp. (2015)

סרטון זה מציג את ההתפתחות וההתמיינות של תאי גזע עצביים אנושיים בתוך פיגום תלת ממדי. ציפוי למינין על הפיגום מקדם את חיבור התא, ואילו תווך עצבי נטול גורמי גדילה גורם להתמיינות תאים לתאי אב עצביים, המרחיבים את התהליכים שלהם בתוך ארכיטקטורה נקבובית לכיוונים מרובים, ויוצרים תרבית תלת ממדית

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. הבחנה HNSC על תרבות תלת מימדית (3D)

הערה: בודד וגזור תאי גזע עצביים אנושיים (hNSCs) מרקמה מאושרת מבחינה אתית שתוארה בפרסום קודם. אנא עקוב אחר ההנחיות האתיות והמוסדיות בעת ביצוע הליך זה.

  1. תרבות תלת ממדית באמצעות צלחת 12 בארות
    1. השתמש בטכניקה אספטית לאורך כל ההליך. בארון בטיחות ביולוגי, יש ללחלח מחדש פיגומים על ידי הוספת 2 מ"ל/באר של 70% אתנול שהוכן באמצעות מים להשקיה (WFIr). הימנע מלגעת בפיגומים על ידי פיזור 70% אתנול במורד הקיר של כל באר.
    2. שאפו בזהירות את האתנול 70% ושטפו מיד את הפיגומים עם 2 מ"ל/באר Dulbecco Modified Eagle Medium F12 (DMEM: F12) למשך דקה אחת. חזרו על הליך השטיפה פעמיים. שאפו בזהירות את ה-DMEM: F12 לאחר השטיפה הסופית.
    3. ציפוי פיגומים על ידי הוספת 2 מ"ל / באר של למינין (10 מיקרוגרם / מ"ל) ב DMEM: F12. צלחת הדגירה ב 37 ° C באינקובטור 5% CO2 לח במשך מינימום של 2 שעות. שטפו את הצלחת עם DMEM חם: F12.
    4. זרעו כל פיגום עם כ-500,000 hNSCs בנפח של 150 μl של RMM+גורמי גדילה (GFs).
    5. דגרו על הצלחת במשך 3 שעות בטמפרטורה של 37°C באינקובטור לח של 5% CO2 כדי לאפשר לתאים לשקוע בפיגומים.
    6. הוסיפו 3.5 מ"ל RMM לכל באר, תוך הקפדה שלא לעקור תאים מפיגומים.
    7. לדגור על הצלחת במשך 7 ימים; להחליף RMM בינוני (3.5 מ"ל / טוב) לאחר 1 יום (האכלה ראשונה) ושוב לאחר 2-3 ימים מן ההאכלה הראשונה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
לא הוכרז על ניגוד עניינים.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
DMEM:F12Invitrogen21331-020להכנת RMM בינונית
פתרון אלבומין אנושי Baxter שירותי בריאות מוגבלת 1501052עבור מדיום RMM בשימוש בריכוז סופי של 0.03%
טרנספרין, רקומביננטי אנושיסיגמאT8158עבור מדיום RMM בשימוש בריכוז סופי של 5 מיקרוגרם/מ"ל
Putrescine DiHCl סיגמאP5780עבור מדיום RMM בשימוש בריכוז סופי של 16.2 מיקרוגרם/מ"ל
אינסולין, רקומביננטי אנושי סיגמאI9278עבור מדיום RMM בשימוש בריכוז סופי של 5 מיקרוגרם/מ"ל
פרוגסטרון סיגמאP6149עבור מדיום RMM בשימוש בריכוז סופי של 60 נ"ג/מ"ל
ל-גלוטמין Invitrogen25030-24עבור מדיום RMM בשימוש בריכוז סופי של 2 mM
נתרן סלניט סיגמאS9133עבור מדיום RMM בשימוש בריכוז סופי של 40 נ"ג/מ"ל
bFGF פפרוטקAF-100-15יש להוסיף למדיום RMM, בשימוש בריכוז סופי של 10 נ"ג/מ"ל
EGF פפרוטקAF-100-188יש להוסיף למדיום RMM, בשימוש בריכוז סופי של 20 נ"ג/מ"ל
4-OHTסיגמאH7904יש להוסיף למדיום RMM, בשימוש בריכוז סופי של 100 ננומטר
למיניןAMS ביוטק3400-010-10
מים להשקיהBaxter HealthcareUKF7114
Alvetex 12 צלחת באר Reinnervate בע מAVP002
אתנול מרק 1.00986.1000

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

מאמרים קשורים