יצירת נוירונים סימפתטיים פוסט-גנגליונים מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים

תקציר

מקור: Wu, H. F., et al. התמיינות יעילה של נוירונים סימפתטיים פוסט-גנגליונים באמצעות תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים בתנאי תרבית נטולי הזנה ומוגדרים כימית. J. Vis. Exp. (2020).

סרטון זה מדגים שיטה במבחנה ליצירת נוירונים סימפתטיים פוסט-גנגליונים מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים (hPSCs). hPSCs מתמיינים לתאי קרסט עצביים (NCC) על תמיכה במטריצת קרום מרתף באמצעות מדיום התמיינות. לאחר מכן ה-NCCs מנותקים ונוצרים לספרואידים באמצעות מדיום התמיינות אחר. לבסוף, הספרואידים הופכים לנוירונים סימפתטיים פוסט-גנגליונים באמצעות מדיום נוירון סימפתטי.

פרוטוקול

1. הגדרה לציפוי כלים, הכנת מדיה ותחזוקת hPSC

1. ציפוי כלים
   1. ציפוי ויטרונקטין (VTN)
      1. הניחו בקבוקונים של VTN באמבט מים בטמפרטורה של 37°C עד להפשרה מלאה, ולאחר מכן ערבבו היטב.
      2. לקבלת צלחת פטרי בקוטר 100 מ"מ, יש לערבב 7 מ"ל של מלח חוצץ פוספט (PBS) אחד עם VTN במינון 0.5 מ"ג/מ"ל, להוסיף תמיסת VTN לצלחת, ולדגור בטמפרטורת החדר (RT) למשך שעה אחת.
   2. ציפוי מטריצת קרום מרתף
      1. הפשירו בקבוקונים של מטריצת קרום מרתף (ראו טבלת חומרים) על קרח בטמפרטורה של 4°C למשך הלילה.
      2. לבאר אחת מתוך צלחת 6 בארות, ערבבו 2 מ"ל של תערובת הנשר הבינוני/מזין F-12 (DMEM/F12) של Dulbecco עם 20 μL של מטריצת קרום מרתף 100x, הוסיפו תמיסת מטריצת קרום מרתף לצלחת, עטפו את המנה בסרט פרפין ואחסנו במיכל נקי בטמפרטורה של 4°C למשך הלילה. עבוד מהר ככל האפשר. כלים מצופים ניתן לאחסן ב 4 ° C עד 2 שבועות.
   3. ציפוי פוליאורניתין (PO)/למינין (LM)/פיברונקטין (FN)
      1. ביום הראשון, עבור באר אחת של צלחת 24 באר, לערבב 15 מיקרוגרם / מ"ל של PO עם 1 מ"ל של 1x PBS, לדגור ב 37 ° C, 5% CO₂ לילה. הפשירו הן LM והן FN בטמפרטורה של -20°C למשך הלילה ואחסנו בטמפרטורה של 4°C עד להפשרה מלאה.
      2. ביום השני, לשאוף תמיסת PO, לשטוף את הבארות 2x עם 1x PBS, להוסיף 1 מ"ל של 1x PBS המכיל 2 מיקרוגרם / מ"ל של LM ו 2 מיקרוגרם / מ"ל של FN ולדגור ב 37 ° C ב 5% CO₂ לילה. בשלב זה ניתן לשמור את המנה עם פתרון LM/FN באינקובטור במשך חודשים כל עוד היא לא מתייבשת. הוסיפו עוד 1x PBS כדי למנוע מהמנה להתייבש.
2. הכנת מדיה
   1. הכינו את המדיום Essential 8 (E8) על ידי הפשרת בקבוק אחד של תוסף E8 בטמפרטורה של 4°C למשך הלילה. יש לערבב את התוסף עם 500 מ"ל מדיום E8 ואנטיביוטיקה במידת הצורך.
      הערה: פתרון E8 עובד צריך להיות מנוצל בתוך 2 שבועות.
   2. הכינו את מדיום ההקפאה hPSC על ידי ערבוב 90 מ"ל של מדיום E8 שלם עם 10 מ"ל של דימתיל סולפוקסיד (DMSO) לנפח כולל של 100 מ"ל. סינון סטריליזציה.
   3. הכינו את היום 0 עד יום 1 למדיום התמיינות על ידי ערבוב 100 מ"ל של מדיום חיוני 6 (E6) עם 10 מיקרומטר SB431542, 1 ננוגרם/מ"ל חלבון מורפוגנטי עצם 4 (BMP4), 300 ננומטר CHIR99021 ו-10 מיקרומטר Y27632 לנפח כולל של 100 מ"ל.
   4. הכן את היום 2 עד יום 10 מדיום בידול על ידי ערבוב 100 מ"ל של מדיום E6 עם 10 מיקרומטר SB ו 0.75 מיקרומטר CHIR99021 לנפח כולל של 100 מ"ל.
   5. הכן את היום 10 עד יום 14 מדיום ספרואידי על ידי ערבוב מדיום נוירובזאלי עם 2 מ"ל של B27 (50x), 1 מ"ל של N2 (100x), 2 mM L-גלוטמט, 3 μM CHIR99021, ו 10 ng / mL פיברובלסט גורם גדילה-2 (FGF2) עבור נפח כולל של 100 מ"ל.
   6. הכינו את היום 14 עד יום 28 בינוני לתחזוקה ספרואידית לטווח ארוך על ידי הוספת 0.5 מיקרומטר של חומצה רטינואית טרייה (RA) ליום 10 עד יום 14 מדיום ספרואידי לכל האכלה.
      הערה: תמיד לשמור RA ב -80 ° C.
   7. הכן את מדיום ההתבגרות של SymN על ידי ערבוב מדיום נוירו-בסיסי עם 2 מ"ל B27 (50x), 1 מ"ל של N2 (100x), 2 מילימטר L-גלוטמט, 25 ננוגרם/מ"ל גורם נוירוטרופי הנגזר מקו תאי גליה (GDNF), 25 ננוגרם/מ"ל גורם נוירוטרופי מוחי (BDNF), 25 ננוגרם/מ"ל גורם גדילה עצבי (NGF), 200 מיקרומטר חומצה אסקורבית, ו-0.2 מילימטר דיבוטיריל אדנוזין מונופוספט מחזורי (dbcAMP) לנפח כולל של 100 מ"ל. הפתרון צריך לשמש בתוך 2 שבועות. לפני כל האכלה, להוסיף 0.125 מיקרומטר טרי RA. פתרון זה משמש מהיום ה-14 (אפשרות 1) או מהיום ה-28 (אפשרות 2).
   8. הכן את מאגר מיון התאים המופעל על ידי פלואורסצנטיות (FACS) על ידי ערבוב DMEM עם 2% FBS, 2 mM L-גלוטמט ואנטיביוטיקה במידת הצורך לנפח כולל של 100 מ"ל.
3. תחזוקת hPSC
   1. הפשרה ושמירה על hPSCs
      1. הכינו צלחת אחת מצופה VTN בקוטר 100 מ"מ.
      2. כדי להפשיר בקבוקון של hPSCs ישירות מחנקן נוזלי, הכניסו את הבקבוקון לאמבט מים של 37 מעלות צלזיוס, והניפו בזהירות את הצינור במים עד שהוא מפשיר. מעבירים את ה-hPSCs המופשרים לצינור של 15 מ"ל המכיל 10 מ"ל של 1x PBS, וצנטריפוגה ב-200 x גרם למשך 4 דקות.
      3. השליכו את הסופרנאטנט והוסיפו 1 מ"ל של מדיום E8 לצינור. פיפטה כמה פעמים כדי להשעות מחדש את הגלולה במלואה ולאחר מכן להוסיף עוד 9 מ"ל של מדיום E8 כדי להגיע 10 מ"ל בסך הכל.
      4. שאפו את פתרון VTN מצלחת 100 מ"מ.
      5. מעבירים את ה-hPSCs לצלחת בקוטר 100 מ"מ, מנערים בעדינות (למעלה-למטה ושמאל-ימין, לא במעגלים) כדי לוודא שהתאים מפוזרים באופן שווה בצלחת
      6. לדגור ב 37 ° C, ב 5% CO₂.
      7. למחרת, לשאוף כל בינוני להאכיל עם 10 מ"ל של E8.
      8. האכילו כך כל יום במשך 3-4 הימים הבאים ואז התכוננו לפיצול.
   2. פיצול hPSCs
      הערה: hPSCs בנקודת הפיצול צריכים להיות 80%-90% במפגש. מושבות גדולות עם קצוות חלקים ובהירים יש לצפות. אולם יש להימנע ממגע בין כל מושבה (איור 1B, יום 0 ואיור 4B).
      1. הכינו כלים מצופים VTN בקוטר 100 מ"מ לפי הצורך.
      2. שאפו את E8 ושטפו את התבשיל שצריך לפצל 1x עם 1x PBS.
      3. שאפו את 1x PBS והוסיפו 4 מ"ל של 0.25 M EDTA. יש לדגור במשך 2 דקות ב-37°C, 5% CO₂.
         הערה: יש לפצל/לצפות מחדש את ה-hPSCs כמושבות קטנות. אין לטפל בחומצה אתילאנדיאמיןטטראצטית (EDTA) יותר מ-2 דקות כדי למנוע הפרדה לתאים בודדים. התאים צריכים להיות עדיין מחוברים למשטח הצלחת לאחר הטיפול של 2 דקות.
      4. שאפו את ה-EDTA, נתקו את המושבות על ידי הזרמה חזקה של 10 מ"ל של תווך E8 על פני המנה, ואספו את כל המדיום והתאים בצינור של 15 מ"ל.
      5. עם hPSCs במפגש של 80%-90%, חלק מושבות בקנ"מ 1:15-1:20. לדוגמה, כדי לפצל hPSCs ביחס של 1:20 לצלחת אחת של 100 מ"מ, יש לקחת 500 μL של תמיסת E8/hPSCs ולערבב עם 9.5 מ"ל של תווך E8 טרי.
      6. צלחת hPSCs בצלחות 100 מ"מ מצופות VTN.
         הערה: מומלץ לקבוע את יחס הפיצול האידיאלי עבור כל חוקר וקו תאים בנפרד.
   3. הקפאת hPSCs
      1. עבור צלחת אחת של 100 מ"מ של hPSCs כי הוא מוכן לפיצול, להכין שלושה cryovials ו 3.5 מ"ל של בינוני הקפאה.
         הערה: יש לשמור את חומרי ההדפסה והבקבוקונים בטמפרטורה של 4°C או על קרח עד לשימוש.
      2. שאפו E8 ושטפו את המנה פי 2 עם 1x PBS.
      3. לשאוף 1x PBS ולהוסיף 4 מ"ל של 0.25 M EDTA, לדגור במשך 2 דקות ב 37 ° C, ב 5% CO₂.
         הערה: יש להקפיא hPSCs כמושבות קטנות בזמן שהם יפוצלו. אין לטפל בתאים עם EDTA יותר מ-2 דקות כדי למנוע הפרדה לתאים בודדים. התאים עדיין צריכים להיות מחוברים על פני השטח של המנה לאחר הטיפול של 2 דקות.
      4. שאפו את ה-EDTA, נתקו את המושבות על ידי פיפטציה חזקה של 10 מ"ל של 1x PBS על פני המנה, ואספו את כל המדיום והתאים בצינור של 50 מ"ל.
      5. הוסף 20 מ"ל של 1x PBS וצנטריפוגה ב 200 x גרם במשך 4 דקות כדי לשטוף את EDTA הנותר.
      6. יש להשליך את הסופרנאטנט ולהשהות מחדש את הגלולה ב-3 מ"ל של מדיום הקפאה.
      7. פזרו hPSCs באופן שווה לשלושת הקריוביאלים, 1 מ"ל כל אחד.
      8. יש לאחסן בטמפרטורה של -80°C למשך הלילה בקופסת הקפאה מבוקרת או בכריך קלקר כדי להבטיח ירידת טמפרטורה איטית, ולאחר מכן להעביר למיכל חנקן נוזלי לאחסון לטווח ארוך.

2. זריעת hPSCs כדי להתחיל את ההבחנה (יום 0)

הערה: hPSCs צריכים להיות מוכנים להתמיינות לאחר התייצבות (כלומר, פיצול 2-3x לאחר הפשרה). ודאו שהמושבות בריאות, עם קצוות חלקים ומבריקים והתמיינות מינימלית (איור 2B).

1. הכינו כלים מצופים מטריצת קרום מרתף (24 באר או 6 כלי באר) יום לפני יום 0 לפי הצורך. הביאו את הכלים ל-RT בתחילת הבידול.
2. הפוך את היום 0-1 בינוני בידול לפי הצורך.
3. שאפו את ה-E8 מה-confluent, מוכן לפצל hPCS, ושטפו את המנה 2x עם 1x PBS.
4. הוסף 7 מ"ל של 0.25 M EDTA לכל צלחת של 100 מ"מ, דגירה ב 37 ° C, 5% CO₂, במשך 15 דקות.
   הערה: בשלב זה, הטיפול ב-EDTA ממושך ומתפזר לתאים בודדים.
5. Pipet את כל hPSCs (הם צריכים להיות צפים) ולהעביר צינור 50 מ"ל. הוסף את אותה כמות או יותר של PBS 1x כמו תמיסת EDTA כדי לדלל את ה- EDTA.
6. צנטריפוגה ב 200 x גרם במשך 4 דקות.
7. להשליך את supernatant, להוסיף 1 מ"ל של יום 0-1 מדיום התמיינות ו pipet כדי הומוגניזציה של התאים. לאחר מכן הוסיפו עוד מדיום ואז ערבבו כדי לדלל את תמיסת התא לריכוז אידיאלי לספירת התאים.
   הערה: אין לדלל יתר על המידה את תמיסת התא. תאים מתוך צלחת אחת מלאה 100 מ"מ צריך להיות מדולל ב 5 מ"ל של בינוני להתחיל.
8. ספור את מספר התא באמצעות מונה תאים אוטומטי או המוציטומטר.
9. לדלל את תמיסת התא לפי הצורך כדי להגיע 125,000 תאים / ס"מ² בנפח סופי נמוך (למשל, 2 מ"ל לבאר עבור צלחת 6 באר או 500 מיקרוליטר לבאר עבור צלחת 24 באר).
   הערה: נפח נמוך מסייע לתאים להתחבר מהר יותר.
10. שאפו את כל תמיסת מטריצת קרום המרתף מהכלים המצופים והכניסו את תמיסת התא לבארות.
11. לדגור ב 37 ° C, ב 5% CO₂.

3. השראת תאי קרסט עצביים (יום 1 עד יום 10, איור 1A)

1. ביום 1 להאכיל את התאים עם יום 0-1 בינוני התמיינות (3 מ"ל לכל באר עבור 6 מנות באר ו 1 מ"ל לכל באר עבור 24 מנות באר).
2. ביום 2 להאכיל את התאים עם יום 2-יום 10 בינוני התמיינות (3 מ"ל לכל באר עבור 6 מנות באר ו 1 מ"ל לכל באר עבור 24 מנות באר).
3. מעתה, יש להאכיל את התאים אחת ליומיים עד יום 10 (כלומר, יום ההזנה הבא יהיה יום 4).
   הערה: מהיום ה-6 ואילך יש לזהות רכסי NC (איור 1B). כדי לבדוק אם מתרחשת התמיינות, מומלץ לשאת תרבית התמיינות מקבילה בבארות קטנות יותר (כלומר, 24 בארות), שניתן לצבוע עבור SOX10/AP2a ולהשתמש בה לביטוי גנים של סמן לאורך זמן ההתמיינות (איור 1B,C).
4. אם אתה ממיין תאים, המשך לסעיף 4. אחרת, המשך לסעיף 5.

4. מיון תאים מופעל פלואורסצנטי (FACS) עבור סמן קרסט עצבי CD49D וצבירת תאי NC בספרואידים

הערה: למיון FACS, הדגימות צריכות להישמר על קרח ולא להיחשף לאור לאחר הצביעה עד המיון.

1. הכן מאגר FACS אם התאים ממוינים.
2. מכינים את היום 10-14 בתווך ספרואידי.
3. ביום 10, להסיר את המדיום, ולשטוף 1x עם 1x PBS.
4. הוסף תמיסת דיסוציאציה (ראה טבלת חומרים) ב 2 מ"ל לבאר עבור צלחת 6 באר או 1 מ"ל לבאר עבור צלחת 24 באר, ולדגור ב 37 ° C, 5% CO₂ במשך 20 דקות.
5. מפטרים את כל ה-hPSCs ומעבירים לצינור של 50 מ"ל.
6. מלא את שאר הצינור במאגר FACS ובצנטריפוגה במהירות של 200 x גרם למשך 4 דקות.
   הערה: כל צינור של 50 מ"ל יכול להכיל עד 20 מ"ל או פחות של תמיסת תאים. עוצמת הקול של מאגר FACS צריכה להיות גבוהה מספיק כדי לנטרל את פתרון הדיסוציאציה.
7. השליכו את הסופרנטנט, השהו מחדש את התאים עם הכמות המתאימה של מאגר FACS (~ 2 מ"ל לכל באר של צלחת 6 באר), וספרו כדי לקבוע את מספר התא.
8. הכינו את הדוגמאות הבאות.
   1. דוגמה 1 (בקרה לא מוכתמת): 1 x 10⁶ תאים במאגר FACS של 400 μL. סנן את התאים דרך מכסה מסננת 20 מיקרומטר ושמור את הצינור על קרח.
   2. דוגמה 2 (בקרת DAPI בלבד): 1 x 10⁶ תאים ב-400 μL של מאגר FACS המכיל 0.5 ug/mL 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI). סנן את התאים דרך צינור FACS עם מכסה מסננת ושמור את הצינור על קרח.
   3. דוגמה 3 (מסומנת בתווית CD49D): יש להשעות את שאר התאים באמצעות מאגר FACS המכיל נוגדן CD49D מצומד פיקואריתרין/ציאנין7 (PE/Cy7) (5 μL עבור 1 x 106 תאים לכל 100 μL של מאגר FACS) בצינור של 15 מ"ל ולדגור על קרח למשך 20 דקות.
9. מלא את הצינורות במאגר FACS ובצנטריפוגה במהירות של 200 x גרם למשך 4 דקות.
10. יש להשליך את הסופרנאטנט ולהשהות מחדש כל 5-10 x 10⁶ תאים ב-1 מ"ל של מאגר FACS המכיל 0.5 ug/mL DAPI בהתאם להוראות היצרן.
11. סנן את התאים דרך צינור FACS עם מכסה המסננת ושמור את הצינור על קרח.
12. הכינו שפופרות FACS לאיסוף המכילות 2 מ"ל של מאגר FACS.
13. מיין את מכשיר FACS באמצעות לייזרים שיכולים לזהות DAPI ו- PE-Cy7 כדי לבודד את אוכלוסיית CD49D⁺.
14. לאחר המיון, ספור את התאים הממוינים.
15. צנטריפוגות את כל התאים הממוינים ומשעשעות מחדש ביום 10-14 תווך ספרואידי לריכוז סופי של 0.5 x 10⁶ תאים לכל 500 מיקרוליטר של תווך.
16. צלחת 0.5 x 10⁶ תאים לכל באר לחיבור נמוך במיוחד 24 צלחות באר.
17. לדגור על התאים ב 37 ° C, ב 5% CO₂.

5. צבירת תאי NC בספרואידים

1. אם אינך משתמש ב- FACS כדי לבודד את תאי NC ובמקום זאת לצבור אותם לספרואידים ישירות, תחילה הכן תאים כמתואר בשלבים 4.2-4.5.
2. מלא את שאר הצינור עם 1x PBS, וצנטריפוגה ב 200 x גרם במשך 4 דקות.
3. השליכו את הסופרנטנט, השהו מחדש את התאים עם כמות מתאימה של יום 10-14 תווך ספרואידי (למשל, ~ 2 מ"ל של מדיום לכל באר עבור צלחת 6 באר), וספרו כדי לקבוע את מספר התא.
4. לדלל את התאים ביום 10-14 ספרואיד בינוני ל 0.5 x 10⁶ תאים לכל 500 μL של בינוני.
5. צלחת 500 μL של השעיית התא לכל באר בחיבור נמוך במיוחד 24 צלחות באר.
6. לדגור על התאים ב 37 ° C, ב 5% CO₂.

6. תחזוקת ספרואידים NC והשראת אב סימפתטית (יום 10 עד יום 14, איור 3A)

1. אפשרות 1: תרבית ספרואידים מינימלית
   1. ביום 11, הוסף 500 μL של יום 10-14 תווך ספרואידי לכדורי NC מבלי לשאוף את המדיום הקיים מיום 10. לדגור ב 37 ° C, ב 5% CO₂.
   2. ביום ה-12, הטו את הצלחת כדי לצבור את כדורי NC בצד אחד של הבארות. בזהירות לשאוף ולהשליך כמה שיותר בינוני, ולהאכיל עם 1 מ"ל של יום 10-14 מדיום spheroid .
   3. המשיכו להזין את התאים כל יום עד היום ה-14.
   4. אופציונלי: אם הספרואידים מצטברים ויוצרים גוש גדול, השתמש בפיפט כדי לפרק את גושי הספרואידים. זה גם מבטיח כי spheroids בודדים לא לקבל גדול מדי.
      הערה: טווח הגודל הספרואידי האידיאלי צריך להיות סביב 100-500 מיקרומטר. בטווח זה, גודלם של ספרואידים בודדים אינו קריטי. אולם המורפולוגיה, כגון קצוות חלקים וברורים (איור 2 ואיור 4) חשובה להצלחה נוספת. ביום ה-14, כל צלחת 24 בארות מכילה באופן אידיאלי כ-50-60 ספרואידים בגדלים שונים בטווח המידות הנ"ל.
2. אפשרות 2: תרבית ספרואידים מורחבת
   1. ביום ה-15, כדי לשמור על כדורי NC, יש להאכיל ב-1.5 מ"ל של מדיום כדורי יום 10-14 המכיל 0.5 מיקרומטר RA. דגירה ב-37°C, 5% CO₂.
      הערה: RA יש להוסיף טרי עבור כל האכלה תמיד להיות מאוחסן ב -80 ° C.
   2. מעתה, יש להאכיל אחת ליומיים עד היום ה-28 ולאחר מכן להמשיך עם ציפוי הספרואידים (סעיף 7.1).
      הערה: הספרואידים הגדלים מפוצלים בערך 1x בשבוע על ידי pipeting אותם עם פיפטה 1 מ"ל כדי לפרק אותם. הם מפוצלים ביחס משוער של 1:2–1:4. בתוך תקופת ההתפשטות של שבועיים, מספר התאים אמור להיות בערך פי ארבעה.

7. התמיינות והתבגרות של נוירון סימפתטי (SymN) (אפשרות 1: לאחר היום ה-14; אפשרות 2: אחרי היום ה-28)

1. ציפוי ספרואידים במנות רגילות
   1. הכינו 24 צלחות באר מצופות PO/LM/FM.
   2. הכינו מדיום symN המכיל 0.125 μM RA (הוסיפו טרי בכל הזנה) ו-10 μM Y27632 (יום 14 בלבד).
   3. ביום ה-14, הטו את הצלחת כדי לצבור כדורי NC בצד אחד של הבארות. בזהירות לשאוף ולהשליך מדיום ככל האפשר, ולהאכיל עם 1 מ"ל של מדיום symN.
   4. הסר LM/FN מהלוחות המצופים.
   5. מפצלים ולוחצים כל באר מצלחת 24 הבארות ל-4 בארות נפרדות של צלחת 24 החדשה והמצופה. בכל באר מקורית יהיה 1 מ"ל, המכיל ~ 50-60 ספרואידים. זה מניב 250 μL, המכיל כ 10-15 ספרואידים עבור כל באר על הצלחת החדשה.
   6. הוסף 250 μL של מדיום נוסף לכל באר.
      הערה: זהו פיצול של 1:4; ודא כי הספרואידים מפוזרים כראוי בתוך התמיסה כך שהפיצול יהיה שווה יחסית. מספר הספרואידים אינו נספר מכיוון שהמספר הסופי אינו משפיע על הצלחת יצירת סימנים.
   7. יש לדגור ב-37°C, 5% CO₂.
   8. ביום ה-15 (או ביום ה-29 עבור אפשרות 2), יש להאכיל על ידי החלפת כל המדיום ב-1 מ"ל של תווך symN המכיל 0.125 מיקרומטר RA. מעתה ואילך, יש להאכיל את הנוירונים כל יומיים עד יום 20 (או יום 35 עבור אפשרות 2).
   9. לאחר יום 20 (או יום 35 עבור אפשרות 2), הנוירונים צריכים להיות מוזנים על ידי החלפה בזהירות רק מחצית של המדיום הקיים (500 μL). מעתה ואילך, להאכיל כל שבוע, אלא אם המדיום הופך במהירות צהוב.
   10. המשך להאכיל מדי שבוע עד לנקודת הזמן הרצויה.
       הערה: סימנים נוטים להצטבר במבנים דמויי גרעינים ונוטים להתנתק ממאכלי התרבות. כדי למנוע זאת, מומלץ חצי האכלה וטיפול מינימלי.

תוצאות

איור 1: אינדוקציה של NC. (A) ציר זמן וטיפולים להשראת NC מהיום ה-0 עד היום ה-10. (B) המורפולוגיה וההיווצרות של רכסי NC נוטרו כל יומיים במיקרוסקופ שדה בהיר. התאים בכל נקודת זמן לאחר יום 2 הוכתמו במשותף עבור AP2A (אדום) ו-SOX10 (ירוק). כל התמונות האימונופלואורסנטיות היו מוכתמות ב-DAPI. חיצים אדומים מציינים את מבני הרכסים. (C) ניתוח qRT-PCR עבור פרופיל ה...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
כלי תרבית תאים בקוטר 100 מ"מ	בז	353003
15 מ"ל צינורות תרבית רקמה חרוטית	VWR/קורנינג	89039-664
צלחות תרבית רקמה 24 בארות	בז	353047
24 צלחות חיבור אולטרה נמוכות	קורנינג	07 200 601 ו 07 200 602
5% CO2/20% O2 אינקובטור תרבית רקמות	תרמו פישר/לייף טכנולוגיות	Heracell VIOS 160i
50 מ"ל צינורות תרבית רקמה חרוטית	VWR/קורנינג	89039-656
צלחות תרבית רקמה 6 בארות	כוכב משנה	3516
אקוטאזה	חדשנות בטכנולוגיות תאים	AT104500	פתרון דיסוציאציה של תאים
נוגדן Anti-AP2a	אבקאם	ab108311	מנחה: ארנב; דילול 1:400
נוגדן Anti-Ascl1	BD Pharmingen	556604	מארח: עכבר IgG1; דילול 1:200
נוגדן Anti-CD49D	ביולג'נד	304313	מארח: עכבר IgG1; 5 μl/מיליון תאים בנפח 100 μl
נוגדן Anti-CD49D (איזוטיפ)	ביולג'נד	400125	מארח: עכבר IgG1; 5 μl/מיליון תאים בנפח 100 μl
נוגדן נגד DAPI	סיגמא	D9542	דילול 1:1000
נוגדן אנטי-DBH	אימונוסטאר	22806	מנחה: ארנב; דילול 1:500
נוגדן נגד GFP	אבקאם	ab13970	מנחה: עוף; דילול 1:1000
נוגדן נגד HOXC9	סנטה קרוז ביוטכנולוגיה	SC-365692	מארח: עכבר IgG1; דילול 1:100
נוגדן Anti-NET1	מאב	נט17-1	מארח: עכבר; דילול 1:1000
נוגדן נגד PRPH	סנטה קרוז ביוטכנולוגיה	SC-377093/H0112	מארח: עכבר IgG2a; דילול 1:200
נוגדן נגד SOX10	אבקאם	ab50839	מארח: עכבר; דילול 1:100
נוגדן אנטי-TH	פל-פריז	P40101- 150	מנחה: ארנב; דילול 1:500
חומצה אסקורבית	סיגמא	A8960-5G	ריכוז במלאי: 100 mM
תוסף B27	תרמו פישר/לייף טכנולוגיות	12587-010	ריכוז במלאי: 50x
BDNF	מערכות מו"פ	248-BD	ריכוז במלאי: 10 מיקרוגרם/מ"ל
BMP4	מערכות מו"פ	314 -BP	ריכוז במלאי: 6 mM
מונה תאים	תרמו פישר/לייף טכנולוגיות	הרוזנת השנייה
שקופיות תא ספירת תאים	Invitrogen	C10312
צנטריפוגה	אפנדורף	57021&5424R
CHIR99021	מערכות מו"פ	4423	ריכוז במלאי: 6 mM
בקבוקון קריו-	תרמו פישר/לייף טכנולוגיות	375353
dbcAMP	סיגמא	D0627	ריכוז במלאי: 100 mM
DMEM	תרמו פישר/לייף טכנולוגיות	10829-018	ריכוז במלאי: 1x
DMEM/F12	תרמו פישר/לייף טכנולוגיות	11330-057	ריכוז במלאי: 1x
DMSO	תרמו פישר/לייף טכנולוגיות	BP231-100
E6 בינוני	גיבקו	A15165-01
E8 בינוני	גיבקו	A15169-01	ריכוז במלאי: 1x
תוסף E8	גיבקו	A15171-01	ריכוז במלאי: 50x
EDTA	סיגמא	ED2SS	ריכוז במלאי: 0.5 מ
מכונת FACS	בקמן קולטר	CytoFLEX (עבור FACS)
מכונת FACS	בקמן קולטר	MoFlo Astrios EQ (למיון)
צינורות FACS (מכסה מסנן כחול)	בז	352235
צינורות FACS (מכסה לבן)	בז	352063
סרום בקר עוברי (FBS)	אטלנטה ביולוגיה	S11150
GDNF	פפרוטק	450	ריכוז במלאי: 10 מיקרוגרם/מ"ל
גלטרקס	Invitrogen	A1413202	מטריצת קרום מרתף; ריכוז במלאי: 100x
hPSCs	תומסון ואחרים, (1998)	WA09
hPSCs	הו ואחרים (2016)	H9-PHOX2B::eGFP
פיברונקטין אנושי (FN)	VWR/קורנינג	47743-654	ריכוז במלאי: 1 מ"ג/מ"ל
ל-גלוטמין	תרמו פישר/גיבקו	25030-081	ריכוז במלאי: 200 mM
מיכל LN	מערכות ביוגניות בהתאמה אישית	V-1500AB
למינין עכבר I (LM)	מערכות מו"פ	3400-010-01	ריכוז במלאי: 1 מ"ג/מ"ל
תוספת N2	תרמו פישר/לייף טכנולוגיות	17502-048	ריכוז במלאי: 100x
מדיום נוירובזאלי	גיבקו	21103-049	ריכוז במלאי: 1x
NGF	פפרוטק	450-01	ריכוז במלאי: 25 מיקרוגרם/מ"ל
מלח חוצץ פוספט (PBS)	גיבקו	14190-136	ריכוז במלאי: 1x
פולי-L-אורניתין הידרוברומיד (PO)	סיגמא	P3655	ריכוז במלאי: 15 מ"ג/מ"ל
פרימוצין (אנטיביוטיקה)	InvivoGen	ANTPM1	ריכוז במלאי: 50 מ"ג/מ"ל
מכונת qPCR	מעבדות Bio-Rad	C1000 עם מסך מגע
צלחות qPCR	מעבדות Bio-Rad	HSP9601
FGF2 רקומביננטי	מערכות מו"פ	233-FB/CF	ריכוז במלאי: 10 מיקרוגרם/מ"ל
חומצה רטינואית	סיגמא	₪625	ריכוז במלאי: 1 mM
SB431542	טוקריס/מערכות מו"פ	1614	ריכוז במלאי: 10 mM
כחול טריפאן	קורנינג	MT-25-900-CI
ויטרונקטין (VTN)	תרמו פישר/לייף טכנולוגיות	A14700	ריכוז במלאי: 0.5 מ"ג/מ"ל
אמבט מים	VWR/קורנינג	706308
Y27632	מערכות מו"פ	1254	ריכוז במלאי: 10 mM