Method Article

יצירת נוירונים סימפתטיים פוסט-גנגליונים מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים

July 8th, 2025

In This Article

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מקור: Wu, H. F., et al. התמיינות יעילה של נוירונים סימפתטיים פוסט-גנגליונים באמצעות תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים בתנאי תרבית נטולי הזנה ומוגדרים כימית. J. Vis. Exp. (2020).

סרטון זה מדגים שיטה במבחנה ליצירת נוירונים סימפתטיים פוסט-גנגליונים מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים (hPSCs). hPSCs מתמיינים לתאי קרסט עצביים (NCC) על תמיכה במטריצת קרום מרתף באמצעות מדיום התמיינות. לאחר מכן ה-NCCs מנותקים ונוצרים לספרואידים באמצעות מדיום התמיינות אחר. לבסוף, הספרואידים הופכים לנוירונים סימפתטיים פוסט-גנגליונים באמצעות מדיום נוירון סימפתטי.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. הגדרה לציפוי כלים, הכנת מדיה ותחזוקת hPSC

  1. ציפוי כלים
    1. ציפוי ויטרונקטין (VTN)
      1. הניחו בקבוקונים של VTN באמבט מים בטמפרטורה של 37°C עד להפשרה מלאה, ולאחר מכן ערבבו היטב.
      2. לקבלת צלחת פטרי בקוטר 100 מ"מ, יש לערבב 7 מ"ל של מלח חוצץ פוספט (PBS) אחד עם VTN במינון 0.5 מ"ג/מ"ל, להוסיף תמיסת VTN לצלחת, ולדגור בטמפרטורת החדר (RT) למשך שעה אחת.
    2. ציפוי מטריצת קרום מרתף
      1. הפשירו בקבוקונים של מטריצת קרום מרתף (ראו טבלת חומרים) על קרח בטמפרטורה של 4°C למשך הלילה.
      2. לבאר אחת מתוך צלחת 6 בארות, ערבבו 2 מ"ל של תערובת הנשר הב....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

figure-results-1
איור 1: אינדוקציה של NC. (A) ציר זמן וטיפולים להשראת NC מהיום ה-0 עד היום ה-10. (B) המורפולוגיה וההיווצרות של רכסי NC נוטרו כל יומיים במיקרוסקופ שדה בהיר. התאים בכל נקודת זמן לאחר יום 2 הוכתמו במשותף עבור AP2A (אדום) ו-SOX10 (ירוק). כל התמונות האימונופלואורסנטיות היו מוכתמות ב-DAPI. חיצים אדומים מציינים את מבני הרכסים. (C) ניתוח qRT-PCR עבור פרופיל ה.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
לא הוכרז על ניגוד עניינים.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
כלי תרבית תאים בקוטר 100 מ"מבז353003
15 מ"ל צינורות תרבית רקמה חרוטיתVWR/קורנינג89039-664
צלחות תרבית רקמה 24 בארותבז353047
24 צלחות חיבור אולטרה נמוכותקורנינג07 200 601 ו 07 200 602
5% CO2/20% O2 אינקובטור תרבית רקמותתרמו פישר/לייף טכנולוגיותHeracell VIOS 160i
50 מ"ל צינורות תרבית רקמה חרוטיתVWR/קורנינג89039-656
צלחות תרבית רקמה 6 בארותכוכב משנה3516
אקוטאזהחדשנות בטכנולוגיות תאיםAT104500פתרון דיסוציאציה של תאים
נוגדן Anti-AP2aאבקאםab108311מנחה: ארנב; דילול 1:400
נוגדן Anti-Ascl1BD Pharmingen556604מארח: עכבר IgG1; דילול 1:200
נוגדן Anti-CD49Dביולג'נד304313מארח: עכבר IgG1; 5 μl/מיליון תאים בנפח 100 μl
נוגדן Anti-CD49D (איזוטיפ)ביולג'נד400125מארח: עכבר IgG1; 5 μl/מיליון תאים בנפח 100 μl
נוגדן נגד DAPIסיגמאD9542דילול 1:1000
נוגדן אנטי-DBHאימונוסטאר22806מנחה: ארנב; דילול 1:500
נוגדן נגד GFPאבקאםab13970מנחה: עוף; דילול 1:1000
נוגדן נגד HOXC9סנטה קרוז ביוטכנולוגיהSC-365692מארח: עכבר IgG1; דילול 1:100
נוגדן Anti-NET1מאבנט17-1מארח: עכבר; דילול 1:1000
נוגדן נגד PRPHסנטה קרוז ביוטכנולוגיהSC-377093/H0112מארח: עכבר IgG2a; דילול 1:200
נוגדן נגד SOX10אבקאםab50839מארח: עכבר; דילול 1:100
נוגדן אנטי-THפל-פריזP40101- 150מנחה: ארנב; דילול 1:500
חומצה אסקורביתסיגמאA8960-5Gריכוז במלאי: 100 mM
תוסף B27תרמו פישר/לייף טכנולוגיות12587-010ריכוז במלאי: 50x
BDNFמערכות מו"פ248-BDריכוז במלאי: 10 מיקרוגרם/מ"ל
BMP4מערכות מו"פ314 -BPריכוז במלאי: 6 mM
מונה תאיםתרמו פישר/לייף טכנולוגיותהרוזנת השנייה
שקופיות תא ספירת תאיםInvitrogenC10312
צנטריפוגהאפנדורף57021&5424R
CHIR99021מערכות מו"פ4423ריכוז במלאי: 6 mM
בקבוקון קריו-תרמו פישר/לייף טכנולוגיות375353
dbcAMPסיגמאD0627ריכוז במלאי: 100 mM
DMEMתרמו פישר/לייף טכנולוגיות10829-018ריכוז במלאי: 1x
DMEM/F12תרמו פישר/לייף טכנולוגיות11330-057ריכוז במלאי: 1x
DMSOתרמו פישר/לייף טכנולוגיותBP231-100
E6 בינוניגיבקוA15165-01
E8 בינוניגיבקוA15169-01ריכוז במלאי: 1x
תוסף E8גיבקוA15171-01ריכוז במלאי: 50x
EDTAסיגמאED2SSריכוז במלאי: 0.5 מ
מכונת FACSבקמן קולטרCytoFLEX (עבור FACS)
מכונת FACSבקמן קולטרMoFlo Astrios EQ (למיון)
צינורות FACS (מכסה מסנן כחול)בז352235
צינורות FACS (מכסה לבן)בז352063
סרום בקר עוברי (FBS)אטלנטה ביולוגיהS11150
GDNFפפרוטק450ריכוז במלאי: 10 מיקרוגרם/מ"ל
גלטרקסInvitrogenA1413202מטריצת קרום מרתף; ריכוז במלאי: 100x
hPSCsתומסון ואחרים, (1998)WA09
hPSCsהו ואחרים (2016)H9-PHOX2B::eGFP
פיברונקטין אנושי (FN)VWR/קורנינג47743-654ריכוז במלאי: 1 מ"ג/מ"ל
ל-גלוטמיןתרמו פישר/גיבקו25030-081ריכוז במלאי: 200 mM
מיכל LNמערכות ביוגניות בהתאמה אישיתV-1500AB
למינין עכבר I (LM)מערכות מו"פ3400-010-01ריכוז במלאי: 1 מ"ג/מ"ל
תוספת N2תרמו פישר/לייף טכנולוגיות17502-048ריכוז במלאי: 100x
מדיום נוירובזאליגיבקו21103-049ריכוז במלאי: 1x
NGFפפרוטק450-01ריכוז במלאי: 25 מיקרוגרם/מ"ל
מלח חוצץ פוספט (PBS)גיבקו14190-136ריכוז במלאי: 1x
פולי-L-אורניתין הידרוברומיד (PO)סיגמאP3655ריכוז במלאי: 15 מ"ג/מ"ל
פרימוצין (אנטיביוטיקה)InvivoGenANTPM1ריכוז במלאי: 50 מ"ג/מ"ל
מכונת qPCRמעבדות Bio-RadC1000 עם מסך מגע
צלחות qPCRמעבדות Bio-RadHSP9601
FGF2 רקומביננטימערכות מו"פ233-FB/CFריכוז במלאי: 10 מיקרוגרם/מ"ל
חומצה רטינואיתסיגמא₪625ריכוז במלאי: 1 mM
SB431542טוקריס/מערכות מו"פ1614ריכוז במלאי: 10 mM
כחול טריפאןקורנינגMT-25-900-CI
ויטרונקטין (VTN)תרמו פישר/לייף טכנולוגיותA14700ריכוז במלאי: 0.5 מ"ג/מ"ל
אמבט מיםVWR/קורנינג706308
Y27632מערכות מו"פ1254ריכוז במלאי: 10 mM
'

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Human Pluripotent Stem CellsNeural Crest CellsSympathetic Neuron DifferentiationBasement Membrane MatrixSpheroid FormationRetinoic Acid TreatmentNeural Progenitor CellsPeripheral Nervous SystemCell Culture IncubatorEDTA Dissociation

Related Articles