$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. הכנות
- הכינו 10 מ"ל של מדיום דיסקציה, והוסיפו 200 מיקרוליטר של 100x פניצילין-סטרפטומיצין ל-9.8 מ"ל של Dulbecco's Modified Eagle Medium F12 (DMEM/F12).
- הכן פתרון L-ציסטאין: ל 10 מ"ל מים עבור תרבית רקמות, ולהוסיף 120 מ"ג של L- ציסטאין. לאחסן את הפתרון L-ציסטאין ב 4 ° C עד 2 שבועות או ב aliquots ב -20 ° C עד 1 שנה.
- הכינו תמיסת DNase I: ל-1 מ"ל מים לתרבית רקמות, הוסיפו 10 מ"ג DNase I. אחסנו את תמיסת DNase I בטמפרטורה של 4°C למשך עד חודשיים.
- הכינו תמיסת פפאין: להכנת תמיסת פפאין, הוסיפו 100 מיקרוליטר פפאין (כ-140 יחידות), 100 מיקרוליטר DNase I (1%) ו-200 מיקרוליטר L-ציסטאין (12 מ"ג/מ"ל) ל-5 מ"ל DMEM/F12. הכינו את תמיסת הפפאין בכל פעם ועיקרו עם מסנן בגודל נקבוביות של 0.22 מיקרומטר לפני השימוש.
- הכינו תמיסת כביסה: להכנת 100 מ"ל של תמיסת כביסה, הוסיפו 650 מיקרוליטר גלוקוז 45%, 500 מיקרוליטר 4-(2-הידרוקסיאתיל)-1-פיפרזיןאתאן-חומצה סולפונית, HEPES 1 M ו-5 מ"ל סרום בקר עוברי (FBS) ל-93.85 מ"ל מלח חוצץ פוספט (DPBS) 1x. יש לעקר את תמיסת הכביסה עם מסנן בגודל נקבוביות של 0.22 מיקרומטר לפני השימוש. אחסנו את תמיסת הכביסה בטמפרטורה של 4°C למשך עד חודשיים.
- הכינו תמיסת אינסולין: כדי להכין 2 מ"ל של תמיסת אינסולין, הוסיפו טיפה של 25 מיקרוליטר של 10 N נתרן הידרוקסידי (NaOH) ו-100 מ"ג אינסולין ל-2 מ"ל מים לתרבית רקמות.
- הכנת תמיסות גורם גדילה אפידרמיס (EGF) וגורם גדילה פיברובלסטי (FGF): המסת שני המיטוגנים ב- DMEM/F12 בריכוז של 100 מיקרוגרם/מ"ל. יש לאחסן כ-10 μl aliquots בטמפרטורה של -20°C.
- הכן מדיה B-27 ו- N-2: לאחסן B-27 ו N-2 תוספי ב -20 ° C כמו 500 μl ו 1 מ"ל aliquots, בהתאמה.
- הכן מדיום מצב התמיינות Z: כדי להכין 100 מ"ל של מדיום מצב התמיינות Z, הוסף 40 μl אינסולין (50 מ"ג / מ"ל), 500 μl B-27, 1 מ"ל N-2, 650 μl גלוקוז 45% ו 1 מ"ל של 100 x פניצילין-סטרפטומיצין לתוך 97.81 מ"ל של DMEM / F12. יש לעקר את מדיום תנאי התמיינות Z באמצעות מסנן בגודל נקבוביות של 0.22 מיקרומטר לפני השימוש. אחסן את תנאי התמיינות Z בינוני ב- 4 ° C למשך עד שבוע אחד.
- הכן מדיום Z-condition: כדי להכין 50 מ"ל של מדיה Z-condition, להוסיף 10 μl של EGF ו 10 μl של FGF לתוך 50 מ"ל של סטרילי Z-differentiation condition medium (20 ng / ml). אחסנו את המדיום Z בטמפרטורה של 4°C למשך עד שבוע.
- הכינו תמיסת ציפוי לתרבית בידול: לתמיסת ציפוי חוץ-תאית של 5 מ"ל, הוסיפו 100 מיקרוליטר של תמיסת מטריצה חוץ-תאית (למשל, מטריג'ל) ל-4.9 מ"ל DMEM/F12. הפשירו תמיסת מטריצה חוץ-תאית בטמפרטורה של 4°C על קרח. לאחר ההפשרה, יש לשמור על טמפרטורה של 4°C למשך עד שבועיים.
2. דיסקציה של מוח דג הזברה הבוגר
- הכינו מיטת דיסקציה על ידי מילוי צלחת פטרי בגודל 100 מ"מ על 15 מ"מ באריזות קרח ג'ל. לאחר מכן מניחים את המכסה על צלחת הפטרי ודגרים ב -20 מעלות צלזיוס עד שהג'ל קופא. על גבי המכסה מניחים ריבוע של נייר סינון נקי ועוטפים הן את נייר הסינון והן את צלחת הפטרי בסרט פלסטיק.
- נקו ועיקרו את כל מכשירי המיקרודיסקציה ב-70% אתנול או בחום לפני כל שימוש. הניחו את כל מכשירי הדיסקציה המעוקרים ליד המיקרוסקופ המנתח, וממש לפני המתת חסד, הניחו את מיטת הדיסקציה מתחת למיקרוסקופ עם תאורת סיבים אופטיים.
- אספו 2 דגי זברה בוגרים להכנת נוירוספרה שלמה במוח; ו-3 עד 4 דגי זברה כדי ליצור נוירוספרות מאזורי מוח מנותחים.
- יש להרדים דגי זברה בוגרים (בני 8-12 חודשים) באמצעות פרוטוקול שאושר על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים. לאחר מכן, לטבול את הדג באתנול 75% למשך 5-10 שניות ולהניח במהירות במיטת הדיסקציה ואחריה עריפת ראש בגובה הזימים באמצעות להב כירורגי.
- כדי להרדים בעלי חיים, יש לתת מנת יתר (300 מ"ג/ליטר) של טריקאין מתאן סולפונט עד שקצב פעימות הלב של בעל החיים מאט בהדרגה וזרימת הדם נעצרת, ואז לטבול במי קרח.
- סובבו את הצד הגבי של הראש כלפי מטה, ובעזרת המספריים בצעו חיתוך אורכי מהצד החתוך אל הפה. באמצעות המלקחיים חושפים את בסיס הגולגולת ומסירים את כל הרקמה הסמוכה. חותכים את הדפנות הרוחביות של הגולגולת מתחילת חוט השדרה לכיוון הטקטום.
- באמצעות המספריים, לחתוך ולהסיר את עצבי הראייה ולאחר מכן להסיר את שני הצדדים של החלק הצדדי ביותר של הגולגולת ברמה של טקטום. סובב את הצד הגחוני של הראש כלפי מעלה. בעזרת מלקחיים, לקלף את שאר החלק האפי ביותר של הגולגולת.
- להעביר את המוח יחד עם החלק הנותר של הגולגולת לתוך צלחת חדשה עם מדיום דיסקציה (1.1). נקו את רקמת המוח במדיום הדיסקציה באמצעות ידית הפלסטיק של סכין המיקרו, תוך שמירה על שלמות כל מבני המוח.
- מנקודה זו, המשיכו את הפרוטוקול באמצעות כל המוח של דגי הזברה.
- לחלופין, התאימו את הפרוטוקול הזה לאזורים מסוימים במוח כדי ליצור נוירוספרות מכל המוח של דגי הזברה או מהטלנצפלון, טקטום/דיאנצפלון או המוח הקטן שנחתחו בעזרת אזמל טרי. השתמשו בקו עצבי ספציפי של דג זברה פלואורסצנטי כדי לנתח את האזור המעניין במוח לפי איור 1.
3. דיסוציאציה של תא בודד במוח בוגר
- בצע את כל העבודה הבאה בארון בטיחות ביולוגי. העבר את רקמת המוח לתוך צינור 1.5 מ"ל המכיל 800 μl של מדיום דיסקציה (מוכן בשלב 1.1). הסר את מדיום הדיסקציה על ידי פיפטציה, מבלי לגעת ברקמת המוח.
- הוסף 500 μl של תמיסת פפאין (שלב 1.4) ולעכל את רקמת המוח ב 37 ° C במשך 10 דקות. אין לדגור יותר מ-15 דקות, שכן הדבר עלול לפגוע בכדאיות התא.
- לאחר הדגירה, להעביר את רקמת המוח עם 500 μl של תמיסת פפאין לתוך צינור חרוטי 15 מ"ל באמצעות קצה צינור 1,000 μl לחתוך ב ~ 0.25 אינץ 'מהתחתית. נתקו בעדינות את רקמת המוח על ידי כך שעלו וירדו באיטיות 10 פעמים באותו קצה. אין לצנרת למעלה ולמטה יותר מ -15 פעמים ואינם יוצרים בועות אוויר במהלך שלב זה, מכיוון שזה עלול לשנות את יכולת הקיום של התא.
- יש לדגור שוב על רקמת המוח בטמפרטורה של 37°C למשך 10 דקות, ולאחר מכן לדגור מעלה ומטה 10-13 פעמים באמצעות קצה רגיל לא חתוך של 1,000 μl. אין לצנרת למעלה ולמטה יותר מ -15 פעמים, כדי למנוע מוות תאי.
- עצור את העיכול האנזימטי על ידי הוספת 2 מ"ל של תמיסת כביסה (שלב 1.5) וצנטריפוגה את תרחיף התא ב 800 x גרם למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר (RT). דקרו בזהירות את הסופרנאטנט והשהו מחדש את הגלולה בתמיסה הנותרת על ידי הקשה נמרצת על הצינור עם אצבע ולאחר מכן על ידי פיפטינג למעלה ולמטה עם קצה רגיל של 1,000 מיקרוליטר. לאחר מכן, להוסיף 2 מ"ל של פתרון כביסה.
- בשלב זה, בדוק תחת המיקרוסקופ כי התקבל תרחיף תא בודד. צנטריפוגה את מתלה התא שוב ב 800 x גרם במשך 5 דקות ב RT. להסיר את supernatant ולהשהות מחדש את הגלולה באמצעות 1 מ"ל של מדיום Z-condition טרי (שלב 1.10).
- צביעת תאים באמצעות טריפאן כחול ולספור את התאים החיים באמצעות hemocytometer על ידי הרחקת תאים מתים כחולים. הכינו צלחת של 24 בארות עם 200 מיקרוליטר של תרחיף תאים ו-300 מיקרוליטר של מדיום Z טרי בכל באר. תאי זרע בצפיפות של ~500 תאים / μl. שמור על תאים בתרבית באינקובטור ב 30 ° C ב 5% CO2, מאז נוירוספרות המוח של דגי זברה אינם גדלים היטב ב 37 ° C.
4. יצירת נוירוספרות ראשוניות
- לאחר יום אחד במבחנה (DiV1), התבוננו בתרחיף התא הבודד המתקבל מהמוח השלם הבוגר תחת המיקרוסקופ ושימו לב אם הצטברה פסולת במרכז הבאר. בזהירות להסיר את כל הלכלוך על ידי pipeting כ 100 μl של בינוני (פחות אם אפשר). לאחר מכן להוסיף 100 μl של Z-condition בינוני טרי. יש לצפות בתרחיפים של תאים בודדים בזמן הזה (איור 2A DiV1).
- לאחר יומיים במבחנה (DiV2), להרחיב את התאים בתרבית. בעזרת פיפטה של 1,000 μl עם קצה החתוך, אספו והעבירו 250 μl של תרחיף תאים מכל באר לבאר חדשה. הוסף 250 μl של מדיום Z טרי לכל הבארות. לפני הרחבת התאים בתרבית, הומוגני את התרחיף בעדינות רבה על ידי pipeting למעלה ולמטה ברחבי הבאר.
- חזור על שלבים 4.1 ו- 4.2 במשך 4 הימים הבאים במבחנה (DiV4). עלייה הדרגתית בגודל הנוירוספרות צריכה להיראות במרכז ובקצוות הבאר ב-DiV3 וב-DiV4 (איור 2B ו-C).
הערה: נוירוספרות ראשוניות יכולות להיות מעובדות לצורך מעבר או התמיינות כדי להעריך רב-עוצמה. לחלופין, הם יכולים להיות מעובדים עבור nucleofection או lipo-transfection כדי לאפיין את התפקיד של גנים ספציפיים במהלך תהליך ההתמיינות.
5. מעבר של נוירוספרות ראשוניות
- הסר 250 μl של תרבית רקמה מכל באר ונתק מכנית נוירוספרות DiV4 עם פיפטה של 1 מ"ל. אין לזרום למעלה ולמטה מהר מדי, שכן היווצרות בועות אוויר עלולה להגביר את מוות התאים.
- ספרו את התאים בעזרת המוציטומטר ופזרו 800 תאים/μl ב-250 מיקרוליטר של תרבית ראשונית לכל באר של צלחת בת 24 בארות.
- הוסף 250 μl של מדיום Z-condition לכל באר.
- לאחר יומיים במבחנה (DiV2), הרחיבו את התאים בתרבית כפי שדווח בשלב 4.2 ו-4.3.
6. הבחנה של נוירוספרות ראשוניות
- יש לעקר את כוסות הכיסוי על ידי טבילה באתנול 70% למשך 10 דקות, ולאחר מכן לייבש את כוסות הכיסוי ב-RT על ידי הכנסתן לכל באר של צלחת בעלת 12 בארות.
- הוסף 300 μl של תמיסת ציפוי חוץ תאית (שלב 1.11) במרכז זכוכית הכיסוי באופן כזה שהוא יכול להתרחב באופן נרחב ולכסות את כל זכוכית הכיסוי. לאחר מכן, לדגור ב 37 ° C במשך 1 שעה (באמצעות אינקובטור תרבית תאים לחות).
- הסירו את תמיסת הציפוי החוץ תאי לאחר הדגירה, וייבשו את הכיסוי למשך שעתיים בטמפרטורה של 37°C.
- הסר 250 μl של תרבית רקמה מכל באר. נתק מכנית את כל הנוירוספרות הראשוניות של DiV4 לכל באר עם פיפטה של 1 מ"ל (עם קצה רחב יותר) על ידי פיפטציה למעלה ולמטה.
- זרעו תרחיפים מנותקים של תאי נוירוספרה בצפיפות תאים של 4 x 103 תאים/מ"ל על כוסות כיסוי מצופות מטריצה חוץ-תאיות שהוכנו בעבר (שלב 6.1-6.3) ולשמור לפחות 30 דקות, בטמפרטורה של 30°C ב-5%CO2, עד לחיבור המצע. לאחר מכן, הסר את מדיום התרבית והוסף במהירות 1 מ"ל של מדיום התמיינות Z טרי שחומם מראש (שלב 1.9) לפני תרבית התאים במשך 24 שעות ב 30 ° C ב 5% CO2.
- כל יומיים, החלף מחצית ממדיום התמיינות Z בזמן התמיינות התא.
