כל ההליכים הכרוכים באיסוף דגימות בוצעו בהתאם להנחיות IRB של המכון.
1. דור אורגנואידים במוח (23 ימים)
- ייזום של neuroectoderm (5 ימים)
הערה: יש לקחת בחשבון את הנקודות הבאות לפני תחילת הבידול. שיטת התכנות מחדש (lentiviral-, sendai-virus-, episomal-, או microRNA מבוסס וכו ') כדי להשיג iPSCs אנושיים צריך להיות באופן אידיאלי זהה עבור כל המטופלים ואת קווי הבקרה iPSC. קיימות ערכות תכנות מחדש שונות והוראות המבוססות על פרוטוקולים שפורסמו. האיכות של קווי iPSC אנושיים היא המפתח להשגת בידול אופטימלי. נטר את המורפולוגיה של המושבה והתא באמצעות מיקרוסקופ ואמת פלוריפוטנציה על ידי בדיקת ביטוי סמנים כגון Oct3/4, Nanog או TRA-1-60.
- תרבית תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים אנושיים בתנאים נטולי מזין במדיום A על צלחת מצופה במטריצת Engelbreth-Holm-Swarm (EHS).
הערה: גדל תאי גזע פלוריפוטנטיים פלוריפוטנטיים (iPSCs) אנושיים ללא מזין ונטול נסיוב כדי לשמור על מצב תרבית מוגדר ולהימנע משלב נוסף להסרת תאי הזנה עובריים של עכברים (MEFs) לפני תחילת ההתמיינות. מספר המעבר האופטימלי עבור תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים אנושיים להתחלת התמיינות נע בין מעבר 15 עם תכנות מחדש למעבר 70 בסך הכל. בעת מעבר, נתק מושבות hiPSC כתאים מצטברים באמצעות תמיסת ניתוק תאים מתאימה עם לחץ מכני נמוך ופיפטה סרולוגית של 2 מ"ל כדי להעביר אגרגטים לצלחת חדשה. הימנע דיסוציאציה לתאים בודדים, שכן זה עלול לגרום התמיינות אפופטוזיס ברוב קווי iPSC. דווח כי מעבר ארוך טווח של תא בודד עשוי להגביר את השינויים הגנומיים בתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים אנושיים. הימנע מהליכי ניתוק תאים, הדורשים שלב צנטריפוגה כדי להסיר את תמיסת הניתוק, מכיוון שהדבר מפחית את הכדאיות הכוללת של תאי גזע פלוריפוטנטיים מוגנים. בדוק את כל התרביות עבור זיהומים מיקרוביאליים, במיוחד מיקופלסמה, על בסיס קבוע, כי זה עלול לשנות את האיכות של iPSCs ואת יכולת ההתמיינות שלהם.
- צפו צלחת תרבית רקמה בקוטר 60 מ"מ במטריצת EHS בהתאם להוראות היצרן.
- הפשיר aliquot של 1 x 106 iPSCs אנושיים. זרעו את ה-iPSCs בצלחת תרבית רקמה בקוטר 60 מ"מ המצופה במטריצת EHS ומכילה 5 מ"ל של מדיום A (ראו טבלת חומרים). שנה את המדיום מדי יום ומעבר לאחר 5 עד 7 ימים כאשר התאים מגיעים ~ 80% confluency.
הערה: עברו את תאי הגזע הפלוריפוטנטיים המושרים במפגש של 80% בשיטות סטנדרטיות, כגון ניתוק ללא אנזימים של מושבות, לפחות פעם אחת לפני תחילת ההתמיינות. בקצרה, הסר את מדיום iPSC, שטוף את התאים פעם אחת עם 37 ° C שחומם מראש Dulbecco's Modified Eagle's Medium: Nutrient Blend F-12 (DMEM/F12), ודגור על iPSCs בהתאם להוראות היצרן באמצעות מגיב A (ראה טבלת חומרים). אין לחרוג מזמן הדגירה המומלץ על מנת למנוע דיסוציאציה לתאים בודדים. תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים אנושיים צריכים להיות מנותקים וצפים כאגרגטים, ולא כתאים בודדים. לאחר מכן ניתן להעביר אותם לכלים חדשים מצופים מטריצת EHS; לדוגמה, ניתן לחלק אגרגטים iPSC מצלחת אחת של 60 מ"מ לארבע מנות חדשות של 60 מ"מ.
b. בדוק מיקופלסמה עם ערכת זיהוי מיקופלסמה בהתאם להוראות היצרן. השתמש רק iPSCs ללא מיקופלסמה, כמו מיקופלסמה יכול לשנות את יכולת ההתמיינות של iPSCs.
- נתקו תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (80% מתמזגים) והכינו תרחיף חד-תאי באמצעות מגיב B
- שטפו את תאי הגזע הזעירים פעם אחת עם DMEM/F12 שחומם מראש (37°C).
- הוסיפו מגיב B שחומם מראש (למשל, 1 מ"ל בצלחת של 60 מ"מ) ודגרו על תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים במשך 5 דקות בטמפרטורה של 37°C ו-5% CO2.
- יש להדביק 20 פעמים עם קצה אצבע בצד ובתחתית המנה כדי לנתק את תאי ה-iPSC. בדוק את ניתוק התאים מתחת למיקרוסקופ.
- פיפטה את השעיית התא למעלה ולמטה בצלחת 5 פעמים עם micropipette 1-mL.
- הוסף 3 מ"ל של בינוני A כדי לדלל 1 מ"ל של מגיב B ולאסוף את תרחיף התא בצינור צנטריפוגה 15 מ"ל.
- סובבו בעדינות את תאי הגזע הפלוריפוטנטיים (iPSC) (500 x גרם) במשך 4 דקות בטמפרטורת החדר.
- להשעות מחדש את גלולת התא ב 1 מ"ל של בינוני B ולספור את מספר התא עם hemocytometer.
הערה: שימו לב לשימוש ב-B בינוני בלבד לצורך השעיה. הימנע משימוש בתווך A, מכיוון שהוא מכיל ריכוז גבוה מדי של bFGF, מה שעלול לעכב את ההבחנה.
- לדלל את תרחיף התא ל 4.5 x 105 תאים למ"ל ב בינוני B בתוספת 10 μM מעכב קינאז חלבון הקשור RHO (Y-27632).
- הוסף 100 μL לכל באר בצלחת לא דבקה, V תחתית, 96 באר.
הערה: ודא שהתאים מפוזרים באופן שווה בתרחיף על ידי ניעור הצינור בכל פעם לפני הוצאת מנות של 100 μL. חשוב שכל באר תכיל מספר תאים שווה ערך על מנת לקבל נוירוספרות הומוגניות בגודל ובצורה (משטחים עגולים ומוגדרים).
- סובבו בעדינות את הצלחת עם התאים בטמפרטורה של 500 x גרם ובטמפרטורת החדר למשך 3 דקות ודגרו ב-37°C ו-5% CO2.
- שנה את המדיום מדי יום על ידי הסרת 50 μL והוספת 50 μL של בינוני B טרי לתוך כל באר במשך 5 הימים הבאים.
2. הטמעת נוירוספרות במטריצת EHS (4 ימים)
- הכן מדיום נוירוספרי על ידי ערבוב הדברים הבאים: תערובת 1: 1: 1 של DMEM/F12 ובינוני C (v/v), 1:200 (v/v) תוספת 1, 1:100 (v/v) תוספת 2 ללא ויטמין A (w/o), 1:100 L-גלוטמין, 0.05 mM חומצות אמינו לא חיוניות (MEM), 100 U/mL פניצילין, 100 מיקרוגרם / מ"ל סטרפטומיצין, 1.6 גרם / ליטר אינסולין, ו 0.05 mM β-mercaptoethanol.
- לאסוף את neurospheres עם micropipette 200 μL באמצעות קצה ~ 2 מ"מ לחתוך בעבר עם מספריים סטריליים.
- מניחים את הנוירוספרות במרחק של כ-5 מ"מ זו מזו על סרט פרפין (3X3 ס"מ2) בכלי ריק של 100 מ"מ ומסירים בזהירות כמה שיותר מהמדיום שנותר.
- הוסף טיפה (7 μL) של מטריצת EHS לכל נוירוספירה בודדת.
- לדגור על טיפות מטריצת EHS עם הנוירוספרות למשך 15 דקות באינקובטור.
- שטפו את הנוירוספרות בזהירות מסרט הפרפין על ידי שטיפתן עם מדיום נוירוספירה. כדי לשטוף, השתמש מיקרופיפטה 1 מ"ל צלחת פטרי חדשה 100 מ"מ המכילה 10 מ"ל של מדיום נוירוספרה.
- לדגור על הנוירוספרות במשך 4 הימים הבאים ולהוסיף 2 מ"ל של מדיום נוירוספירה טרי ביום 2.
הערה: ודאו שהמדפים באינקובטור שטוחים כדי שהנוירוספרות המשובצות במטריצת EHS לא יתקבצו יחד בצד אחד של המנה.
3. אורגנואידים בתרבית השעיה סיבובית (14 יום)
- הכן מדיום אורגנואיד במוח על-ידי ערבוב הפעולות הבאות: תערובת 1:1 של DMEM/F12 ו-C בינוני (v/v), 1:200 (v/v) תוספת 1, תוסף 1:100 (v/v) 2 עם ויטמין A, 1:100 L-גלוטמין, 0.05 mM MEM, 100 U/mL פניצילין, 100 מיקרוגרם/מ"ל סטרפטומיצין, 1.6 גרם/ליטר אינסולין, 0.5 מיקרומטר דורסומורפין, 5 מיקרומטר SB431542, ו 0.05 mM β-mercaptoethanol.
- הוסיפו 100 מ"ל של תווך אורגנואיד מוחי לכל בקבוק ספינר דרך זרועותיו הצדדיות והניחו אותם באינקובטור לחימום מקדים למשך 20 דקות לפחות.
- הגדר תוכנית ערבוב ב 25 סל"ד, על פי הוראות היצרן.
הערה: לפני העברת הנוירוספרות המשובצות במטריצת EHS לצלוחיות ספינר, ודא שכולם מופרדים. אם שניים או יותר מחוברים דרך מטריצת EHS, הפרד אותם על ידי חיתוך המטריצה המחברת עם אזמל.
- העבר בזהירות את הנוירוספרות המשובצות במטריצת EHS לצלוחיות ספינר המכילות 100 מ"ל של תווך אורגנואיד באמצעות פיפטה סרולוגית של 2 מ"ל. השתמש בזרועות הצד של בקבוק הספינר כדי להעביר את הנוירוספרות לתוך הצלוחית.
- הניחו את צלוחיות הספינר על משטח ערבוב מגנטי באינקובטור בטמפרטורה של 37°C ו-5% CO2; זהו היום ה-0 של תרבית האורגנואידים.
- שנה את המדיום פעם בשבוע (או לעתים קרובות יותר כאשר יש שינוי צבע) על ידי הסרת מחצית המדיום והוספת אותה כמות של מדיום טרי.
הערה: כאשר מוציאים את צלוחיות הספינר מהאינקובטור, המתינו 3-5 דקות כדי לתת לאורגנואידים לשקוע לתחתית הצלוחית. הסר את המדיום על ידי הנחת קצה פיפטה זכוכית (מחובר למשאבה) על פני השטח של הנוזל; יש לשאוף את המדיום בזהירות דרך פתח/זרוע צד אחד של הצלוחית. מניפולציות אלה חייבות להיעשות מתחת למכסה המנוע הלמינרי.