התמיינות הנגרמת על ידי גירוי חשמלי של תאי גזע עצביים ותאי אב

תקציר

מקור: Chang, H. et al., Electric-Field-Induced Neural Precursor Cell Differentiation in Microfluidic Devices.J. Vis. Exp. (2021)

סרטון זה מדגים את השימוש בשבב מיקרופלואידי חוץ-תאי מצופה מטריצה כדי להבדיל תאי גזע עצביים ותאי אב או NPCs באמצעות גירוי חשמלי. לאחר הזריעה וההיצמדות לאזור המצופה, NPCs גדלים, ויישום זרם ישיר מעורר את התמיינותם לנוירונים, אסטרוציטים ואוליגודנדרוציטים.

פרוטוקול

1. תכנון וייצור השבב הרב-ערוצי, השקוף אופטית, אלקטרוטקטי (MOE)

1. ציירו תבניות עבור שכבות פולימתיל מתקרילט בודדות (PMMA) והסרט הדו-צדדי באמצעות תוכנה מתאימה (איור 1A, טבלת חומרים). חתכו גם את יריעות ה-PMMA וגם את הסרט הדו-צדדי בעזרת מכונת לייזר CO₂ (איור 1B).
   1. הפעל את כותב הלייזר CO₂ וחבר אותו למחשב אישי. פתח את קובץ הדפוסים המעוצב באמצעות התוכנה.
   2. הניחו את יריעות PMMA (275 מ"מ x 400 מ"מ) או את סרט הדבקה הדו-צדדי (210 מ"מ x 297 מ"מ) על משטח כתב הלייזר (איור 2A). מקד את הלייזר על פני השטח של יריעות PMMA או על הסרט הדו-צדדי באמצעות כלי המיקוד האוטומטי.
   3. בחר את כתב הלייזר כמדפסת, ולאחר מכן "הדפס" את התבנית באמצעות כתב הלייזר כדי להתחיל את האבלציה הישירה על גיליון PMMA או סרט דו-צדדי ולקבל תבניות נפרדות על גיליון PMMA או סרט (איור 2B).
2. הסר את סרט המגן מיריעות PMMA ונקה את פני השטח באמצעות גז חנקן.
   הערה: שרטוט תבנית PMMA ועיבוד ישיר של גיליון PMMA בוצעו על פי דו"ח קודם.
3. לחיבור שכבות מרובות של יריעות PMMA, ערמו שלוש חתיכות של יריעות PMMA בקוטר 1 מ"מ (שכבות 1, 2 ו-3), וקשרו אותן בלחץ של 5 ק"ג/ס"מ² במליטה תרמית למשך 30 דקות ב-110°C כדי ליצור את מכלול תעלת הזרימה/גירוי חשמלי (איור 2C).
   הערה: לאצוות שונות של יריעות PMMA שהושגו באופן מסחרי יש טמפרטורות מעבר זכוכית (Tg) שונות במקצת. טמפרטורת ההדבקה האופטימלית צריכה להיבדק במרווחים של 5 מעלות צלזיוס קרוב ל- Tg.
4. הדביקו 12 חלקים של מתאמים לפתחים הבודדים בשכבה 1 של מכלול שבבי MOE עם דבק ציאנואקרילט מהיר.
   הערה: המתאמים עשויים PMMA על ידי הזרקה. המשטחים השטוחים בתחתית מיועדים לחיבור לשבב MOE. המתאמים הנושאים חוטי בורג נקבה 1/4W-28 מיועדים לחיבור תקעים לבנים הדוקים לאצבעות, מחברים תחתונים שטוחים או מתאמי Luer. היזהר בעת שימוש בדבק ציאנואקרילט מהיר. יש להימנע מהתזה לתוך העיניים.
5. חיטאו את מצעי PMMA בקוטר 1 מ"מ (שכבות 1-3), את הסרט הדו-צדדי (שכבה 4) ואת מצעי PMMA (שכבה 5) בדירוג אופטי של 3 מ"מ באמצעות קרינה אולטרה סגולה (UV) למשך 30 דקות לפני הרכבת השבב (איור 1A).
6. הדביקו את מצעי ה-PMMA בקוטר 1 מ"מ (שכבות 1-3) על מצעי PMMA (שכבה 5) בדירוג אופטי של 3 מ"מ עם הסרט הדו-צדדי (שכבה 4) כדי להשלים את הרכבת ה-PMMA (שכבות 1-5) (איור 1A).
7. הכינו את זכוכית הכיסוי הנקייה להרכבה על השבב.
   1. מלאו דילול פי עשרה של חומר הניקוי בצנצנת מכתימה (ראו טבלת חומרים), ונקו את זכוכית הכיסוי בחומר ניקוי זה באמצעות חומר ניקוי אולטראסוני למשך 15 דקות.
   2. שטפו היטב את צנצנת הכתמים תחת מי ברז זורמים כדי להסיר את כל שאריות חומר הניקוי.
   3. יש להמשיך לשטוף במים מזוקקים כדי להסיר את כל שאריות מי הברז ולחזור על שלב 1.7.2 פעמיים.
   4. יבשו את זכוכית הכיסוי הנקייה על ידי ניפוחה עם גז חנקן.
8. חיטאו את מכלול ה-PMMA (שכבות 1-5), את הסרט הדו-צדדי (שכבה 6) ואת זכוכית הכיסוי (שכבה 7) באמצעות הקרנת UV בתוך ארון בטיחות ביולוגית למשך 30 דקות לפני הרכבת השבב (איור 1A).
9. הדביקו את זכוכית הכיסוי המנוקה (שכבה 7) למכלול PMMA (שכבות 1-5) בעזרת סרט דו-צדדי (שכבה 6) (איור 1A).
10. דגור על שבב MOE בתא ואקום למשך הלילה; השתמש במכלול שבב MOE להליכים הבאים (איור 3).

2. ציפוי פולי-L-ליזין (PLL) על המצע באזורי תרבית התא

1. הכינו את צינור הפוליטטרה-פלואוראתילן, מחבר בעל תחתית שטוחה, מחבר חרוט, מתאם חרוט-לואר, תקע לבן צמוד אצבע (נקרא גם פקק), מתאם Luer, מזרק Luer lock ובאנג גומי שחור (איור 4A, טבלת חומרים). לעקר את כל הרכיבים הנ"ל autoclave ב 121 ° C למשך 30 דקות.
2. אטמו את פתחי מתאמי גשר האגר (איור 1A) בעזרת התקעים הלבנים הדוקים את האצבעות. חברו את המחבר בעל התחתית השטוחה למכלול שבבי MOE באמצעות מתאמי הכניסה והשקע הבינוניים (איור 4B). חבר את מתאם הקונוס-Luer לסטופקוק התלת-כיווני.
3. הוסף 2 מ"ל של תמיסת PLL 0.01% באמצעות מזרק 3 מ"ל המתחבר לסטופקוק התלת-כיווני של הכניסה הבינונית (איור 4B-).
4. חבר מזרק ריק של 3 מ"ל לסטופקוק התלת-כיווני של השקע הבינוני (איור 4B-).
5. מלא את אזורי תרבית התאים בתמיסת PLL. שאבו ידנית את תמיסת הציפוי קדימה ואחורה באיטיות. סגור את שני הסטופקוקים התלת-כיווניים כדי לאטום את התמיסה בתוך אזורי התרבות.
6. לדגור על שבב MOE ב 37 ° C במשך הלילה באינקובטור מלא 5% CO₂ אטמוספירה.

3. הכנת רשת גשרי המלח

1. לאחר שלב 2.6, פתחו את שני הסטופקוקים התלת-כיווניים ושטפו את הבועות בתעלות על ידי שאיבה ידנית של תמיסת הציפוי קדימה ואחורה בתעלה באמצעות שני המזרקים.
2. ציירו 3 מ"ל של מדיום שלם (מדיום תחזוקת תאי גזע המורכב מתערובת התזונה F-12 (DMEM/F12) של Dulbecco, תוסף B-27, 20 ng/mL EGF ו-20 ng/mL bFGF) לתוך מזרק 3 מ"ל שמתחבר לסטופקוק התלת-כיווני של הכניסה הבינונית (איור 4B- ואיור 4B- ).
3. הוסף 3 מ"ל של תווך שלם כדי להחליף את תמיסת הציפוי באזורי תרבית התא. חבר מזרק ריק של 5 מ"ל לסטופקוק התלת-כיווני של השקע הבינוני (איור 4B-).
4. הכינו את רשת גשרי המלח (איור 5).
   1. חתכו את באנג הגומי השחור כדי ליצור רווח והכניסו את אלקטרודות הכסף (Ag)/כסף כלוריד (AgCl) דרך באנג הגומי השחור לתוך מזרק נעילת Luer (איור 4A).
   2. החלף את התקע הלבן האטום לאצבע במתאם Luer, והזריק אגרוז חם 3% כדי למלא את מתאם Luer.
      הערה: להכנת האגרוז החם, ממיסים 3 גרם אבקת אגרוז ב -100 מ"ל של מלח חוצץ פוספט (PBS) ומעקרים באוטוקלאבה ב 121 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
   3. חבר את מזרק מנעול Luer למתאם Luer. הזריקו אגרוז חם 3% דרך באנג הגומי השחור כדי למלא את מזרק Luer Lock באמצעות המזרק עם מחט. המתינו 10 עד 20 דקות עד שהאגרוז יתקרר ויתמצק.
      הערה: כדי להגדיל את קיבולת הנפח של האגרוז, מזרק Luer Lock מותקן על מתאם Luer (איור 4 ואיור 5). לאחר מכן, האלקטרודות הגדולות מוכנסות לתוך מזרק Luer lock. האלקטרודה מסוגלת לספק גירוי חשמלי יציב לניסוי ארוך הטווח.

4. הכנת mNPCs

1. תרבית את mNPCs בתווך השלם בבקבוק תרבית תאים 25T ב 37 ° C באינקובטור מלא 5% CO₂ אטמוספירה. תרבית תאים כל 3-4 ימים ולבצע את כל הניסויים עם תאים שעברו 3-8 מעברים מהמקור המקורי.
2. מעבירים את תרחיף התא לצינור חרוטי בנפח 15 מ"ל, ומסובבים את הנוירוספרות במהירות של 100 × גרם למשך 5 דקות. שאפו את הסופרנאטנט ושטפו את הנוירוספרות עם 1x Dulbecco's PBS (DPBS). סובב את הנוירוספרות ב 100 × גרם במשך 5 דקות.
3. שאפו את 1x DPBS ולאחר מכן להשעות מחדש את הנוירוספרות במדיום השלם. מערבבים היטב ובעדינות.
4. הוסף 1 מ"ל של המתלה הנוירוספרי באמצעות מזרק 1 מ"ל המתחבר לסטופקוק התלת-כיווני של השקע (איור 4B-).

5. הגדרת המערכת המיקרופלואידית לגירוי פולס DC (איור 6)

1. התקן את שבב MOE מזרעי תאים על מחמם אינדיום-בדיל-אוקסיד (ITO) שקוף המהודק על שלב ממונע X-Y-Z הניתן לתכנות.
   הערה: טמפרטורת פני השטח של ITO נשלטת על ידי בקר פרופורציונלי-אינטגרלי-נגזרת ונשמרת על 37 מעלות צלזיוס. זוג תרמי מסוג K מהודק בין השבב למחמם ITO כדי לפקח על הטמפרטורה של אזורי תרבית התאים בתוך השבב. שבב MOE מותקן על שלב ממונע X-Y-Z הניתן לתכנות ומתאים לרכישת תמונה אוטומטית בהילוך מהיר בקטעי ערוץ בודדים. ייצור מחמם ITO והתקנת מערכת חימום תרבית התאים תוארו בעבר.
2. להחדיר את mNPCs על ידי שאיבה ידנית לתוך שבב MOE דרך שקע בינוני. לדגור על שבב MOE זרעי תאים על מחמם ITO 37 ° C במשך 4 שעות.
3. לאחר 4 שעות, יש לשאוב את התווך המלא דרך שבב MOE דרך כניסת התווך בקצב זרימה של 20 μL/h באמצעות משאבת מזרק.
   הערה: mNPCs גדלים ומתוחזקים בשבב למשך 24 שעות נוספות לפני גירוי שדות חשמליים (EF) כדי לאפשר חיבור תאים וצמיחה. נוזל הפסולת נאסף במזרק ריק בנפח 5 מ"ל המחובר לסטופקוק התלת-כיווני של השקע, ומוצג כ"פסולת" באיור 6A. תצורת המערכת המיקרופלואידית של MOE מוצגת באיור 6. מערכת מיקרופלואידית זו מספקת אספקה רציפה של תזונה לתאים. המדיום הטרי המלא נשאב ברציפות לתוך שבב MOE כדי לשמור על ערך pH קבוע. לכן, ניתן לגדל את התאים בתרבית מחוץ לאינקובטור_CO2.
4. השתמש בחוטי חשמל כדי לחבר מרבב EF לשבב MOE באמצעות אלקטרודות Ag/AgCl שעל השבב. חבר מרבב EF ומחולל פונקציות למגבר כדי להפיק פעימות DC של גלים מרובעים בעוצמה של 300 mV/mm בתדר של 100 הרץ במחזורי עבודה של 50% (50% זמן הפעלה ו-50% פסק זמן) (איור 6B).
   1. חבר את חוטי החשמל למרבב EF. חבר את חוטי החשמל לשבב MOE באמצעות אלקטרודות Ag/AgCl.
   2. חבר את המרבב EF למגבר באמצעות חוטי חשמל. חבר את מחולל הפונקציות למגבר ולאוסצילוסקופ הדיגיטלי.
      הערה: מרבב EF הוא מעגל הכולל את העכבה של תא התרבות במעגל ומחבר את כל התאים הבודדים ברשת אלקטרונית מקבילית. כל אחד משלושת תאי התרבית מחובר חשמלית טורית לנגד משתנה (Vr) ומד זרם (מוצג כ-μA באיור 6A) במרבב. הזרם החשמלי דרך כל תא תרבית משתנה על ידי שליטה ב- Vr, והזרם מוצג על מד זרם המתאים. עוצמת השדה החשמלי בכל אזור תרבית תאים חושבה על ידי חוק אוהם, I= σEA, כאשר I הוא הזרם החשמלי, σ (מוגדר כ- 1.38 S·^m-1 עבור DMEM/F12) הוא המוליכות החשמלית של תווך התרבית, E הוא השדה החשמלי, ו- A הוא שטח החתך של התא האלקטרוטקטי. עבור ממד אזור תרבית התאים המוצג באיור 1, הזרם החשמלי הוא ~87 mA ו~44 mA עבור פולס DC ו- DC במחזור עבודה של 50%, בהתאמה.
5. הכפיפו את mNPCs לפעימות DC מרובעות בעוצמה של 300 mV/mm בתדר של 100 הרץ למשך 48 שעות. שאבו ברציפות את התווך המלא בקצב של 10 μL/h כדי לספק תזונה נאותה לתאים ולשמור על ערך pH קבוע בתווך.

תוצאות

איור 1: התצורה המפורטת של השבב האלקטרוטקטי הרב-ערוצי השקוף אופטית.(A) תצוגה מפוצצת של מכלול השבבים של משרד החינוך. שבב MOE מורכב מיריעות PMMA (50 מ"מ x 25 מ"מ x 1 מ"מ), סרט דו-צדדי (50 מ"מ x 25 מ"מ x 0.07 מ"מ), מתאמים (10 מ"מ x 10 מ"מ x 6 מ"מ), גיליון PMMA בדירוג אופטי (50 מ"מ x 75 מ"מ x 3 מ"מ), סרט דו-צדדי (24 מ"מ x 60 מ"מ x 0.07 מ"מ), וזכוכית כיסוי (24 מ"מ × 60 מ"מ). ישנם שלושה תא...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
מצעי PMMA בקוטר 1 מ"מ (שכבות 1-3)	BHT	K2R20	פולימתיל מתקרילט (PMMA), http://www.bothharvest.com/zh-tw/product-421076/Optical-PMMA-Non-Coated-BHT-K2Rxx-xx=-thickness-choices.html
15 מ"ל צינור פלסטיק	Protech טכנולוגיה הארגון ושות', בע ' מ	CT-15-PL-TW	צינור תחתון חרוטי עם כובע, התאספו, מעוקר מראש
מזרק 3 מ"ל	טרומו	DVR-3413	3 מ"ל מזרקים אוראליים, ללא מחט
PMMA בדירוג אופטי של 3 מ"מ (שכבה 5)	תאגיד CHI MEI	גיליון ACRYPOLY PMMA	PMMA בדירוג אופטי
סטופרקוק תלת-כיווני	ניפרו	NCN-3L	סטופקוק חד פעמי סטרילי תלת כיווני
מזרק 5 מ"ל	טרומו	DVR-3410	5 מ"ל מזרקים אוראליים, ללא מחט
מתאם	דונג Zhong ושות', בע ' מ	מותאמים אישית	מתאם PMMA
אגרוז	סיגמא-אולדריץ'	A9414	אגרוז, טמפרטורת ג'לינג נמוכה
מגבר	א.א. לאב מערכות בע"מ	A-304	מגבר מתח גבוה
תוכנת AutoCAD	אוטודסק	גרסה חינוכית	שרטוט
תוספת B-27	גיבקו	12587-010	תוסף B-27 (פי 50), פחות ויטמין A
גורם גדילה פיברובלסט בסיסי (bFGF)	פפרוטק	AF-100-18B	נקרא גם FGF אנושי רקומביננטי בסיסי
בונג גומי שחור	טרומו	DVR-3413	מ 3 מ"ל מזרקים אוראליים, ללא מחט
אלבומין בסרום בקר (BSA)	סיגמא-אולדריץ'	B4287	חסימת מגיב
צנטריפוגה	HSIANGTAI	CV2060	צנטריפוגה
סופר לייזר CO2	חברת לייזר כלים וטכנולוגיה	ILS-II	נרכש מ http://www.lttcorp.com/index.htm
מחבר חרוט	IDEX בריאות ומדע	F-120X	קונוס 10-32 צמוד אצבעות מקשה אחת, לקבלת OD טבעי בגודל 1/16 אינץ'
מתאם Cone-Luer	IDEX בריאות ומדע	P-659	מתאם Luer 10-32 נקבה לנקבה Luer, PEEK
מיקרוסקופ פלואורסצנטי קונפוקלי	לייקה מיקרוסיסטמס	TCS SP5	מדריך למשתמש Leica TCS SP5, http://www3.unifr.ch/bioimage/wp-content/uploads/2013/10/User-Manual_TCS_SP5_V02_EN.pdf
מצלמה דיגיטלית	אולימפוס	E-330	רכישה אוטומטית של תמונות עם קיטועי זמן
אוסצילוסקופ דיגיטלי	טקטרוניקס	TDS2024	למדוד אותות מתח או זרם לאורך זמן במעגל אלקטרוני או רכיב אלקטרוני כדי להציג משרעת ותדר.
סרט דו-צדדי	3 דקות	PET 8018	נרכש מ http://en.thd.com.tw/
תערובת החומרים המזינים F-12 (DMEM/F12) של Dulbecco	גיבקו	12400024	DMEM/F-12, אבקה, HEPES
מלח חוצץ פוספט של Dulbecco (DPBS)	גיבקו	21600010	DPBS, אבקה, ללא סידן, ללא מגנזיום
מרבב EF	אסיה סקיי ושות', בע ' מ	מותאמים אישית	נטר ושלוט בזרם החשמלי בערוצים נפרדים
גורם גדילה אפידרמיס (EGF)	פפרוטק	AF-100-15	נקרא גם EGF אנושי רקומביננטי
דבק ציאנואקרילט מהיר פעולה	3 דקות	7004T	חוזק דבק מיידי (נוזל)
מחבר תחתון שטוח	IDEX בריאות ומדע	P-206	דלרין אגוז זכר ללא אוגן, 1/4-28 תחתון שטוח, לכחול OD בגודל 1/16 אינץ'
מחולל פונקציות	אג'ילנט טכנולוגיות	33120א	מחולל פונקציות מסונתז 15 MHz בעל ביצועים גבוהים עם יכולת צורת גל שרירותית מובנית
זכוכית אינדיום-בדיל-תחמוצת (ITO)	מרק	300739	עבור מחמם ITO
זוג תרמי מסוג K	טקפל	TPK-02A	טמפרטורה thermocouples
מתאם Luer	IDEX בריאות ומדע	פ618-01	מתאם Luer נקבה Luer ל 1/4-28 פוליפרופילן זכר
מזרק Luer Lock	טרומו	DVR-3413	לגשרי מלח אגר
מלח חוצץ פוספט (PBS)	חיים בסיסיים	BL2651	תמיסת כביסה
פולי-ל-ליזין (PLL)	סיגמא	עמ' 4707	פתרון ציפוי
כיסוי מדויק בעובי משקפיים מס' 1.5H	מרינפלד	107242	https://www.marienfeld-superior.com/precision-cover-glasses-thickness-no-1-5h-tol-5-m.html
שלב ממונע X-Y-Z ניתן לתכנות	Tanlian Inc	מותאמים אישית	נרכש מ http://www.tanlian.tw/ndex.files/motort.htm
בקר פרופורציונלי-אינטגרלי-נגזרת (PID)	טוהו אלקטרוניקה	TTM-J4-R-AB	בקר טמפרטורה
צינור PTFE	פלסטיקה מקצועית בע"מ סניף טייוואן	קוטר חיצוני 1/16 אינץ'	צינורות PTFE לבנים שקופים
משאבת מזרק	ניו ארה מערכות בע"מ	NE-1000	NE-1000 משאבת מזרק יחיד ניתנת לתכנות
חומר ניקוי TFD4	פרנקלאב	TFD4	כיסוי זכוכית מנקה
בונדר תרמי	Kuan-MIN טק ושות'	מותאמים אישית	נרכש מ http://kmtco.com.tw/
שואב אולטראסוני	אריה	LEO-300S	מנקה סטרי אולטראסוני
תא ואקום	דנג YNG מכשירים ושות', בע מ	דב-30	תנור ייבוש בוואקום
תקע לבן אטום לאצבעות	IDEX בריאות ומדע	P-316	1/4-28 תחתון שטוח, https://www.idex-hs.com/store/fluidics/fluidic-connections/plug-teflonr-pfa-1-4-28-flat-bottom.html