$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
כל ההליכים הכרוכים באיסוף דגימות בוצעו בהתאם להנחיות IRB של המכון.
איור 1 מדגים סקירה סכמטית של זרימת העבודה של פרוטוקול זה.
1. תכנות מחדש ותחזוקה של iPSC
- יש לאסוף 8 מ"ל מהדם של הנבדק (מבוגר או חולה מחלה; גילאי 65 ומעלה) לתוך צינורות הכנת תאים (CPT) עם נתרן ציטראט או לתוך חומצה ethylenediaminetetraacetic (EDTA) או צינורות heparinized.
- צנטריפוגה במהירות 1,800 x גרם למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר (RT) לאיסוף גלולות המכילות דם היקפי בלבד וללא סרום.
- השתמש בווקטורים מיוחדים לתכנות מחדש בהתאם לפרוטוקול היצרן (ראה טבלת חומרים) כדי להשיג iPSCs.
- תאי גזע מושרים ב-LDEV (LDEV) ללא מזין וללא לקטוז דהידרוגנאז (LDEV)-ללא גורם גדילה מופחת מטריצת קרום מרתף מצופים 6 צלחות תרבית בארות במדיה חיונית 8 (E8) (ראה טבלת חומרים) ב-37°C באטמוספירה לחה עם 5% CO2.
- יש לשמור על תאי גזע מושרים במדיית E8 למשך 3-4 ימים על מנת למנוע צפיפות או בידול ספונטני.
- אמת את הפלוריפוטנציה של קווי iPSC באמצעות סמנים אימונופלואורסצנטיים (שלב 2) ובדוק מיקופלסמה (שלב 3).
2. צביעת פלוריפוטנציה
- כדי לשמר תמיסות ונוגדנים, זרעו את התאים על צלחות תרבית מצופות (שלב 1.4) 24 בארות 3-4 ימים לפני הניתוח. שאפו את המדיום עם פיפטה וקבעו את התאים עם 4% פורמלדהיד במי מלח חוצצים פוספט (1x PBS) למשך 15-20 דקות ב-RT.
- שטפו את התאים 3x עם 1x PBS וחדרו עם 0.1% Triton-X 100 in 1% אלבומין בסרום בקר (BSA) ב-PBS למשך 15 דקות לפחות, אך לא יותר משעה אחת ב-RT.
- שטפו 3x עם 1x PBS וחסמו עם 5% BSA ב-PBS למשך 30 דקות ב-RT.
- יש לשטוף שוב 3x עם 1x PBS ולהוסיף את הנוגדנים Sox2 ו-Oct3/4 (דילול 1:100; ראו טבלת חומרים), ואת כתם הגרעין DAPI ב-1% BSA (דילול 1:4,000) למשך הלילה ב-4°C. יש לעטוף ברדיד אלומיניום להגנה מפני אור.
- שטפו 3x עם 1x PBS והשאירו את התאים ב-PBS. תמונה במיקרוסקופ פלואורסצנטי בהגדלה של פי 10-20. ודא שסמני הפלוריפוטנציה אזור קביעת המין Y-box 2 (Sox2) וגורם שעתוק קשירת אוקטמר 3/4 (Oct3/4) ממוקמים בגרעין התאים.
3. בדיקת מיקופלסמה
הערה: עיין בפרוטוקול של ערכת האיתור (ראה טבלת חומרים) לקבלת שלבים מפורטים לביצוע וניתוח הבדיקה. ערכת הזיהוי מספקת את המגיב, המצע ומאגר הבדיקה לבדיקת מיקופלסמה.
- לפני העברת תאים או מדיום רענון, אספו 2-3 מ"ל של מדיום תרבית תאים בצינור צנטריפוגה ושחררו את כל התאים או הפסולת במהירות של 200 x גרם למשך 5 דקות ב- RT. אחסנו את הסופרנאטנט בטמפרטורה של 4°C למשך ≤5 ימים. לדגור על התאים עם המדיום במשך 24 שעות לפחות כדי להבטיח אות לזיהוי.
- יש להוסיף 100 μL של תא-על-נאטנט לצינור טרי או לבאר של צלחת בעלת דופן לבנה בעלת 96 בארות (מומלץ להשתמש בתחתית אטומה, ראו טבלת חומרים). הרכיבו מחדש את המגיב והמצע במאגר הבדיקה ושיווי משקל למשך 15 דקות ב- RT.
- הוסף 100 μL של מגיב לדגימה ודגר במשך 5 דקות ב RT. למדוד את ההארה עם luminometer (מדידה #1).
- הוסף 100 μL של המצע לדגימה ודגר במשך 10 דקות ב RT. למדוד את ההארה (מדידה #2).
- לקבוע את זיהום מיקופלסמה על ידי יחס המדידה #2 ל #1. עיין במדריך הערכה לפירוש התוצאות.
4. הכנת מיקרופילמנט
- התחל את הכנת המיקרופילמנטים הפולי (חומצה לקטית-קו-גליקולית) (PLGA, ראה טבלת חומרים) על ידי שחיקת גדיל התפר עם הקצה הקהה של אזמל. עקרו קלות את הסיב המרופט עם 70% אתנול.
- תחת המיקרוסקופ ובאמצעות סרגל, מתחילים לחתוך את סיבי PLGA לשברים של גדילים באורך 500 מיקרומטר עד 1 מ"מ. חותכים כ -25 מ"מ מהסיבים בסך הכל. שמור את החוטים בצינור 15 מ"ל עם 1 מ"ל פתרון אנטיביוטי-אנטי-מיקוטי.
- במכסה המנוע, דללו את תמיסת הסיבים עם 10 מ"ל של DMEM/F-12 (טבלה 1). מערבולת היטב כדי לערבב את הפתרון.
הערה: עבודה בתרבית תאים בסביבה סטרילית.
- הוסף 20 μL של תמיסת הסיבים לשלושה גופים עובריים (EB) היוצרים בארות של צלחת 96 בארות. תחת מיקרוסקופ brightfield, לספור ולממוצע את הסיבים לכל באר. לדלל או להתרכז בממוצע 5-10 microfilaments PLGA לכל באר. הכינו כל באר באופן זה.
- הבארות מוכנות כעת להזרעה עם תאים. אחסנו את הצלחת בטמפרטורת החדר עד לצורך או בטמפרטורה של 4°C ליום המחרת.
5. היווצרות גוף עובר (EB)
הערה: יש לחמם את כל המדיה והפתרונות ל- RT.
- ברגע שהגזעים הפלוריפוטנטיים מושרים הגיעו למפגש של 70%-80% (איור 2A), הם מוכנים למעבר ולשימוש ליצירת EB. בדוק את התאים עם מיקרוסקופ בהגדלה של 10x-20x. ודא שהמושבות מציגות אזורים מינימליים (<10%) של בידול ספונטני.
- שאפו את המדיום עם פיפטה ושטפו את התאים פעם אחת עם מלח חוצץ פוספט (DPBS) של Dulbecco. נתק את המושבות על ידי הוספת 500 μL של תמיסת ניתוק תאים (ראה טבלת חומרים) או 0.5 מילימטר של EDTA ודגרה במשך 3-5 דקות ב 37 ° C.
הערה: עבודה בתרבית תאים בסביבה סטרילית.
- אספו את התאים ששוחררו על ידי הוספת 1 מ"ל של מדיה E8 טרייה לכל באר ופיפטה בעדינות עד שכל התאים מנותקים.
- העבר 1.5 מ"ל של תרחיף תאים לצינור של 15 מ"ל, והוסף עוד 1 מ"ל של מדיה E8 טרייה כדי להגיע לנפח כולל של 2.5 מ"ל.
- צנטריפוגה ב 290 x גרם במשך 3 דקות ב RT.
- שאפו את הסופרנאטנט עם פיפטה, השהו מחדש את כדורית התא ב-1 מ"ל של מדיה חיונית 6 (E6, ראו טבלת חומרים) בתוספת מעכב חלבון קינאז הקשור ל-Rho (ROCK) של 50 מיקרומטר, וספרו את התאים באמצעות המוציטומטר.
- הכינו תרחיף תאים של 60,000-90,000 תאים/מ"ל, בהתאם לצפיפות הזריעה הרצויה, במדיית E6 בתוספת 50 מיקרומטר של מעכב ROCK (ראו טבלת חומרים).
- הוסף 150 μL של תרחיף התא לכל באר של צלחת חיבור 96 באר נמוכה במיוחד (ULA) (או צלחת קעורה מוכנה). זרעו 9,000-11,000 תאים לבאר.
- צנטריפוגה את הצלחת כדי לצבור בכוח את התאים ב 290 x גרם במשך דקה אחת ב RT. מניחים את הצלחת באינקובטור ב 37 ° C באווירה לחה עם 5% CO2.
6. אינדוקציה נוירואפיתל
- לאחר 24 שעות, בזהירות לשאוף 120 μL של התקשורת עם פיפטה. ודא לא לשאוף את EB על ידי הורדת קצה פיפטה רחוק מדי לתוך הבאר.
- הוסף 150 μL של מדיה E6 (ב RT) בתוספת 2 μM של XAV939 ואת מדכא אמהות נגד מעכבי Decapentaplegic (SMAD): 10 מיקרומטר של SB431542 ו 500 ננומטר של LDN 193189 לכל באר (ראה טבלה של חומרים).
- שנה את המדיום מדי יום עם מדיה E6 מוכן טרי בתוספת 2 מיקרומטר של XAV939, 10 מיקרומטר של SB431542, ו 500 ננומטר של LDN 193189.
הערה: ביום 6 (DIV6), ה- EBs צריכים להיות בקוטר של 550-600 מיקרומטר ולהיות מוכנים להבחנה נוספת.
7. התמיינות והתבגרות אורגנואידים
הערה: יש לחמם את כל המדיה ל- RT.
- בקירוב DIV7, בדקו אם כל ה-EBs הגיעו לקוטר של 550-600 מיקרומטר ומציגים קצה חלק וברור (איור 2B); בשלב זה הם מוכנים להטמעה במטריצה חוץ-תאית (ECM).
הערה: עבודה בסביבה סטרילית.
- הכינו יריעות הטבעה מסרט האיטום התרמופלסטי (ראו טבלת חומרים) על ידי הנחת יריעת פילם (באורך של כ-12 ס"מ) על קופסת P200 ריקה. באמצעות צינור חרוטי 15 מ"ל או צינור מיקרוצנטריפוגה 500 μL, לחץ בעדינות על יריעת הסרט לתוך החורים כדי ליצור 12 גומות. רססו את יריעת הסרט באתנול 70% והניחו לה להתייבש בתוך מכסה המנוע כאשר אור ה-UV דולק למשך 30 דקות לפחות.
- הפשירו כמות מספקת של מטריצת קרום מרתף (Matrigel, ראו טבלת חומרים) על קרח והניחו אותה בתוך מכסה הזורם.
הערה: לכל EB, יש צורך בכ -30 μL של מטריצת קרום לא מדוללת. יש לשמור תמיד על מטריצת הממברנה מתחת ל-4°C כדי למנוע ממנה להצטמרר. קצות פיפטה מקוררים מראש מומלצים גם מכיוון שהם מאטים את המטריצה מפילמור בקצה במהלך פיפטינג, ובכך מפחיתים את אובדן החומר.
- בעזרת קצה P200 רחב, העבירו EB אחד לכל גומה, והסירו כמה שיותר מדיה עם קצה פיפטה רגיל. שימו לב לא לתת ל-EBs להתייבש. באמצעות קצה P200 רגיל, הוסף ~ 30 μL של מטריצת קרום לא מדוללת לכל אורגנואיד, וודא שה- EB נמצא במרכז הטיפה.
- לאחר שכל EBs מוטמעים במטריצה, מקם את יריעת הסרט המכילה את EBs בצלחת פטרי סטרילית.
הערה: לחלופין, ניתן להניח צלחת פטרי קטנה מלאה במים סטריליים בצלחת הפטרי הגדולה יותר ליד יריעת הסרט כדי למנוע אידוי.
- מעבירים את המנה לאינקובטור ודגרים בטמפרטורה של 37°C באווירה לחה עם 5%CO2 למשך כ-10 דקות כדי לאפשר למטריצת הממברנה להתמצק.
- עבור כל קבוצה של 12 אורגנואידים משובצים, הכינו 5 מ"ל של אמצעי התמיינות עם B27 ללא ויטמין A (טבלה 1) בבאר אחת של צלחת ULA 6 בארות. מחממים מראש את הצלחת ל 37 מעלות צלזיוס באינקובטור.
- לאחר סיום זמן הדגירה, העבר את ה- EBs המוטבעים לצלחת ULA 6-well על ידי לקיחת יריעת הסרט ודחיפת הגומות מגב הסדין. במידת הצורך, קח 1 מ"ל מהבאר ופיפט אותו על היריעה כדי לעזור לטיפות להתנתק מהסרט.
הערה: שינויים מורפולוגיים חשובים ניתן לראות יום אחד לאחר ההטבעה; EBs עוברים מקצוות חלקים לבליטות בולטות היוצרות ניצנים (איור 2C).
- לאחר יומיים (DIV9), בצע שינוי חצי מדיה. היזהרו שלא לשאוף או לפגוע בטיפות מטריצת הממברנה בתהליך.
- לאחר יומיים נוספים (DIV11), בצע שינוי מדיה מלא, והשלים את המדיה עם 3 מיקרומטר של CHIR99021 (ראה טבלת חומרים).
- ב-DIV14, שנו את המדיה למדיה מבדלת עם B27 עם ויטמין A (טבלה 1) להגדלה הדרגתית של גודל האורגנואידים.
- ב- DIV16, הניחו את צלחת הבאר על שייקר מסלול ב -90 סל"ד בתוך אינקובטור. שנה את המדיה כל יומיים.
- כל 40 DIV, לדלל 500 μL של מטריצת הממברנה עבור כל 50 מ"ל של מדיה עבור חומרים מזינים נוספים במדיה.
טבלה 1: הרכב אמצעי הבידול שנעשה בהם שימוש במחקר הנוכחי.
| מגיב | ריכוז סופי | נפח (50 מ"ל סה"כ) |
| DMEM-F12 | 50% | 25 מ"ל |
| מדיום נוירובזלי | 50% | 25 מ"ל |
| תוסף N2 (100x) | 1x | 0.25 מ"ל |
| תוסף B27 -/+ ויטמין A (50x) | פי 0.5 | 0.5 מ"ל |
| אינסולין | 0.25% | 12.5 מיקרוליטר |
| GlutaMAX (פי 100) | 1x | 0.5 מ"ל |
| MEM-NEAA (פי 100) | פי 0.5 | 0.25 מ"ל |
| HEPES (1 מטר) | 10 מ"מ | 0.5 מ"ל |
| אנטיביוטיקה/אנטי-מיקוטית (100x) | 1x | 0.5 מ"ל |
| 2-β-מרקפטואתנול | 50 מיקרומטר | 17.5 מיקרוליטר |
| הערה: חלק מה-DMEM-F12 כבר מכיל GlutaMAX, אין צורך להוסיף עוד. |
