$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
כל ההליכים הכרוכים באיסוף דגימות בוצעו בהתאם להנחיות IRB של המכון.
1. דיסקציה של עוברים ודיסוציאציה של רקמות
- נקבות חולדות בוגרות (200-250 גרם) בטמפרטורה קבועה (22 ± 1 מעלות צלזיוס) ובלחות יחסית (50%) תחת לוח זמנים קבוע של אור-חושך (אור דולק 7:00-19:00) במתקן בעלי החיים. ודא כי מזון ומים זמינים באופן חופשי.
- מרדימים חולדה הרה לאחר 18 ימי התפתחות (E18) באמצעות איזופלורן 3%. לאחר מכן, להקריב את החיה על ידי נקע צוואר הרחם.
- הוציאו את ההיפוקמפוסי מכל עובר חולדה והכניסו אותו לתמיסת מלח מאוזנת של האנק קר כקרח ללא Ca2+ ו-Mg2+. ביום ה-18 להתפתחות, רקמות ההיפוקמפוס וקליפת המוח רכות מאוד ואין צורך לחתוך אותן לחתיכות קטנות. פרטים נוספים ניתן למצוא.
- נתקו את הרקמה ב-0.125% מתמיסת טריפסין/האנק המכילה 0.05% DNAse למשך 18-20 דקות ב-37°C.
- הסר את תמיסת הסופרנאטנט עם פיפטת פסטר ועצור את העיכול האנזימטי על ידי הוספת מדיום עם סרום בקר עוברי 10% (FBS) למשך 5 דקות.
- הסר את המדיום עם FBS ושטוף פעם אחת עם המדיום עם התוסף שלו, 1% L-גלוטמין, גנטמיצין 10 מיקרוגרם / מ"ל. להסיר שוב את המדיום עם פיפטה פסטר ולמלא אותו שוב עם כמות קטנה (500 מיקרוליטר) של מדיום צמיחה עם התוסף שלה, 1% L-גלוטמין, גנטמיצין 10 מיקרוגרם / מ"ל.
- מנתקים את גלולת הרקמה באופן מכני עם פיפטה צרה של פסטר עד שמתגלה תרחיף חלבי של תאים. אין צורך לצנטריפוגה את השעיית התא.
- לדלל את נפח קטן של השעיית התא עם מדיום הצמיחה כדי לקבל נפח סופי של 2.0 מ"ל. לספור את הריכוז הסלולרי המתקבל עם תא hemocytometer. יש לדלל ריכוז זה ביחס של 1:5 על מנת לקבל את ריכוז התאים הרצוי של 600-700 תאים/מיקרוליטר.
2. ציפוי תאים
- תאי צלחת בצפיפות של כ-2,000 תאים/מ"מ2 על האזור הפעיל של MEA, המוגדר על ידי אילוץ PDMS ליצירת רשת עצבית דו-ממדית.
הערה: כל היפוקמפוס מכיל בערך 5 x 105 תאים, (1 x 106 עבור עובר יחיד). נתח 6 עוברים כדי לקבל כמות כוללת של 6 x 106 תאים ב 2 מ"ל, וריכוז משוער של 3,000 תאים / μl. לדלל ריכוז זה ב 1:5 על מנת לקבל את ריכוז התא הרצוי צלחת על 600-700 תאים / μl. אם אזור MEA המופרד על ידי אילוץ PDMS הוא בערך 7.065 מ"מ2, והמספר הכולל של תאים מצופים 600 תאים/μl x 24 μl = 14,400 תאים, הצפיפות הסופית של 2,038 תאים/מ"מ2.
- מקם את מכשירי MEA לתוך האינקובטור עם אטמוספירה CO2 לח (5%) ב 37 ° C.
- פזרו 160 μl של התרחיף עם ריכוז תאים של 600-700 תאים/μl (כ-100,000 תאים) על פני השטח של חד-שכבה של מיקרו-חרוזים הממוקמת בתוך לוחות מרובי בארות כדי להשלים את השלב המקדים לבניית תרבית תלת-ממדית. שים את לוחות multiwell באינקובטור עם אטמוספירה CO2 לחות (5%) ב 37 °C (75 °F).
3. 3D בניית רשת עצבית
- 6-8 שעות לאחר הציפוי, מעבירים את המתלה (מיקרו-חרוזים עם נוירונים) מהלוחות מרובי בארות בזהירות רבה בתוך האזור התחום על ידי אילוץ PDMS באמצעות פיפטה שנקבעה לנפח של כ 30-40 מיקרוליטר. לאחר כל העברה, המתינו כחצי דקה, כדי לאפשר למיקרו-כדוריות להתאסף בעצמן במבנה קומפקטי משושה.
- לאחר שכל השכבות שוקעו והורכבו באופן ספונטני, מלאו מחדש בטיפה גדולה של כ-300 מיקרוליטר בינוני בחלק העליון של השטח התחום על ידי אילוץ PDMS.
- שים את המבנה התלת-ממדי המחובר ל-MEA באינקובטור (T = 37.0 ° C, CO2 = 5%) למשך 48 שעות לפני הוספת נפח סופי (כ -1 מ"ל) של תרבית בינונית גידול עם התוסף שלו.
הערה: שקול את המספר הכולל של חרוזים על לוחות multiwell עם תוספת ממברנה (30,000) ואת מספר החרוזים על שכבה אחת על התקן MEA (6,000). המבנה התלת-ממדי המתקבל מורכב מ-5 שכבות של מיקרו-חרוזים ותאים. בהתחשב בכך שהרשת העצבית התלת-ממדית אינה מושלמת מבחינה גיאומטרית, המבנה התלת-ממדי המתקבל יכול לכלול 5-8 שכבות.
- יום לאחר הציפוי, מוסיפים בזהירות את הנפח הסופי של המדיום (כ-900 מיקרוליטר) בתוך טבעת MEA. שמור על תרביות 3D באטמוספירה CO2 לח (5%) ב 37 ° C במשך 4-5 שבועות. החליפו מחצית מהמדיום פעם בשבוע.