כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.
1. הכנה וטיפוח של אסטרוציטים קורטיקליים
הערה: השלימו את השלבים האלה של הפרוטוקול לפחות 7 d לפני שתמשיכו לשלבים הבאים, מכיוון שתרביות האסטרוציטים צריכות להתפתח לחד-שכבות מתמזגות לפני הכנת הנוירונים. אסטרוציטים ראשוניים מופקים מתרביות גליה מעורבות המתקבלות מגורי עכברים בסביבות היום שלאחר הלידה (P) 0-3. יש להשתמש בשלושה מוחות (6 קליפות) לכל בקבוק T75.
- הכינו את מדיום האסטרוציטים על ידי השלמת מדיום הנשר המעובד של דולבקו (DMEM) עם 10% נסיוב סוסים v/v ו-0.1% v/v גנטמיצין בתנאים סטריליים. יש לאחסן את המדיום בטמפרטורה של 4°C למשך עד שבועיים.
- ציפוי 3x T75 צלוחיות עם 10 מיקרוגרם/מ"ל פולי-D-ליזין (PDL; במים ברמת תרבית תאים) למשך שעה אחת לפחות ב-37°C בנוכחות 6% v/v CO2. לאחר הציפוי, שטפו את הצלוחיות פעמיים במי מלח חוצצי פוספט (PBS) כדי להסיר קטיונים לא קשורים, והוסיפו 9 מ"ל אסטרוציטים בינוניים.
- להכנת המוחות, הוסיפו 10 מ"ל תמיסת מלח מאוזנת של האנק (HBSS) לצלחת פטרי 1x 10 ס"מ ו-1 מ"ל HBSS לצינור 1x 15 מ"ל (ללא קשר למספר המוחות שישמשו). יש להחזיק זוג מספריים כירורגיים, 2 מלקחיים עדינים ומשקפת בהישג יד לצורך ההליך.
- ערפו את ראשיהם של 3 גורים במהירות בעזרת המספריים הכירורגיים ואספו את הראשים בכלי ריק בקוטר 10 ס"מ.
- בצע את הכנת קליפת המוח מתחת למשקפת. בעזרת שני מלקחיים עדינים, מסירים את העור הגבי מהגולגולת בקו האמצע, החל מהצוואר ומעלה לכיוון גובה העיניים. לאחר מכן, המוח עם כלי הדם שלו נראה מתחת לגולגולת.
- מקבעים את הראש בקצה הרוסטרלי בעזרת זוג מלקחיים וחותכים את קו האמצע של הגולגולת, החל מהקצה האחורי. לאחר מכן, חתכו את החצי הימני והשמאלי של הגולגולת כדי לחשוף את המוח.
- סגרו את קצה המלקחיים ומקמו אותו בגחון מתחת למוח. הרימו את המוח מהגולגולת והעבירו אותו לצלחת פטרי מלאה ב-HBSS בקוטר 10 ס"מ. המשיכו באותו אופן עם הדגימה הנותרת עד שכל המוחות נאספים בצלחת.
- לאחר איסוף המוחות, התחילו עם הפרדת קליפת המוח על ידי צביטת המוח האחורי באמצעות זוג מלקחיים כמו זוג מספריים. בצע חתך קו אמצע בין שתי ההמיספרות עם זוג אחד של מלקחיים. בזהירות לתקן את המוח עם מלקחיים לחתוך את המוח התיכון ואת פקעות הריח באמצעות מלקחיים שנייה כדי לסיים עם חצאי קליפת המוח.
- תקן חצי קליפת מוח אחת עם זוג מלקחיים אחד וקילף את קרומי המוח מההמיספרות על ידי ניתוקם מהקצה הצידי ולאחר מכן משיכתם מפני השטח של קליפת המוח באמצעות מלקחיים שנייה.
- הפכו את החצי קליפת המוח כשפני השטח שלו מכוונים כלפי מטה לכיוון המנה; נתחו בזהירות והסירו את ההיפוקמפוס בצורת חצי סהר באמצעות זוג מלקחיים אחד. העבירו את קליפת המוח הבודדת לתוך צינור חרוטי של 15 מ"ל באמצעות מלקחיים סגורים אחד כדי לשאת קליפת מוח בודדת.
- לאחר איסוף כל קליפת המוח, לעבור למכסה המנוע זרימה למינרית סטרילית ולהתחיל עם ההכנות לדיסוציאציה של רקמת קליפת המוח.
- הוסף 1 מ"ל DMEM לצינור תגובה של 2 מ"ל והוסף 0.1% עם פפאין (30 יחידות). לדגור את התרחיף באמבט מים ב 37 ° C עד פתרון ברור מתפתח (כ 3 דקות). יש להוסיף 0.24 מ"ג/מ"ל L-ציסטאין ו-20 מיקרוגרם/מ"ל DNAse ולנער בעדינות.
הערה: לעיכול, יש צורך בכ-1 מ"ל של תמיסת אנזים.
- סנן (גודל נקבוביות 0.22 מיקרומטר) כדי לקבל תמיסה סטרילית של 1 מ"ל לפני הוספתו לרקמת קליפת המוח. לדגור את הצינורות במשך 30 דקות - 1 שעה ב 37 ° C (כלומר, באמבט מים).
הערה: שלבים 1.11 - 1.14 הם קריטיים ויש להשלים אותם תוך 15 דקות.
- כדי לסיים את תגובת העיכול, להוסיף 1 מ"ל אסטרוציטים בינוני בזהירות triturate את הרקמה מעוכל באמצעות פיפטה 1 מ"ל. עבור trituration, בעדינות להזיז את הבוכנה פיפטה, ובכך לשאוף ו extruding את השעיית רקמת קליפת המוח.
- לאחר שהרקמה נותקה לתרחיף חד-תאי, הוסף מדיום אסטרוציטים 5 מ"ל וצנטריפוגה למשך 5 דקות במהירות של 216 x גרם.
- שאפו את הסופרנאטנט בזהירות מהגלולה המתקבלת והשעו מחדש את התאים בתווך אסטרוציטים של 1 מ"ל.
- הוסף את מתלי התאים לצלוחיות T75 המתחדשות בתווך אסטרוציטים 9 מ"ל (ראה 1.2).
- לדגור את התאים ב 37 ° C באינקובטור בנוכחות 6% v/v CO2. לאחר 4 d, בצע את השינוי הבינוני המלא הראשון (10 מ"ל). לאחר מכן, לשנות את מדיום התרבות כל 2 - 3 ימים.
- לאחר 7 ימים, בדוק אם התאים יצרו monolayer confluent. אם לא, המתן עוד 2-3 ימים עד להשגת מפגש מלא של התרבות.
הערה: אסטרוציטים מציגים גופי תאים גדולים ושטוחים, מתמקמים בתחתית הצלוחית ואינם מפתחים תהליכים תאיים בולטים. הם נבדלים מתאי האב הבהירים הקטנים בעלי ניגודיות הפאזה והמיקרוגליה השוכנים על גבי החד-שכבתי.
- על מנת להיפטר מתאי האב ולקבל תרבית אסטרוציטים טהורה, הניחו את צלוחיות T75 על שייקר מסלולי, ונערו את התרביות O/N ב-250 סל"ד. ודא כי הטמפרטורה מותאמת ל 37 ° C וכי המסנן של בקבוק אטום עם סרט מעבדה כדי למנוע אידוי של CO2.
- למחרת, שאפו את המדיום והוסיפו 10 מ"ל מדיום תרבית טרי מתחדש עם 20 מיקרומטר ציטוזין-1-β-D-arabinofuranoside (AraC) כדי לחסל תאים מתחלקים שיורית.
הערה: דגירה עם AraC עבור 2 - 3 d באינקובטור ב 37 ° C, 6% CO2 יגרום לתרבית אסטרוציטים טהורה.
- עקוב אחר טוהר תרביות האסטרוציטים על ידי בדיקה חזותית תחת מיקרוסקופ האור. אם תאי אב בהירים ותאי מיקרוגליה בעלי ניגודיות פאזה שיורית עדיין שוכנים על גבי החד-שכבה האסטרוציטית (ראה שלב 1.16), חזור על שלבים 1.18 ו- 1.19.
הערה: ניתן לשמור על חד-שכבות אסטרוציטים קונפלונטיות וטהורות עד 14 d באינקובטור (37 ° C, 6% v/v CO2) לפני שתמשיך לשלב הבא. שנה מחצית מהמדיום כל 3 ד'. אין לאסוף, להקפיא ולהפשיר את האסטרוציטים, שכן תאים אלה יאבדו את התכונות התומכות העצביות שלהם באמצעות הליך האחסון.
2. הכנת אסטרוציטים לתרבות העקיפה
הערה: 48 - 72 שעות לפני הכנת הנוירונים, מעבירים אסטרוציטים לתוספות תרבית התא. באופן כללי, בקבוק T75 יחיד מספק מספר מספיק של תאים כדי לתמוך בתרביות העצביות המתקבלות בהכנה אחת.
- הכניסו כמה שיותר תוספות לפי הצורך ל-24 צלחות. יש לצפות כל תוספת ב-PDL של 10 מיקרוגרם/מ"ל (מומס במים ברמת תרבית תאים) למשך כשעה אחת בטמפרטורה של 37°C, 6% v/v CO2. לאחר הדגירה, שטפו את התוספות פעמיים עם PBS. בינתיים, להמשיך עם הכנת אסטרוציטים.
הערה: ניתן לשמור את התוספות המלאות ב-PBS עד שתרחיף תאי האסטרוציטים מוכן לשימוש.
- שאפו את מדיום האסטרוציטים (עם AraC) ושטפו את התרבית פעם אחת עם PBS של 10 מ"ל כדי להבטיח שכל שאריות הסרום יוסרו.
- הוסף 3 מ"ל של 0.05% טריפסין-EDTA (חומצה אתילאנדיאמיןטטראצטית) לצלוחיות ודגר על התאים לטריפסיניזציה ב 37 ° C, 6% v/v CO2 במשך כ -10 דקות.
- שלוט בניתוק התא על ידי בדיקה חזותית באמצעות מיקרוסקופ והקל על ניתוק התאים על ידי הקשה על צד הצלוחיות כנגד שולחן העבודה.
הערה: שלבים 2.5 - 2.8 הם קריטיים ויש לסיים אותם תוך 15 - 20 דקות.
- לאחר הטריפסיניזציה, להשהות מחדש בעדינות את התאים בתווך אסטרוציטים 7 מ"ל ולהעביר את תרחיף התא לצינור 15 מ"ל. צנטריפוגה למשך 5 דקות ב 216 x גרם.
- בזהירות לשאוף את supernatant ולהשעות מחדש את גלולת התא בתווך אסטרוציטים 1 מ"ל.
- ספירת התאים באמצעות תא ספירה.
- מלא את תחתית הבארות של צלחת 24 בארות בתווך אסטרוציטים 500 μL והעבר 25,000 תאים בתווך אסטרוציטים 500 μL לכל תוספת בודדת. לדגור על התרבית ב 37 ° C, 6% v/v CO2.
הערה: לאחר 42 - 72 שעות התרבויות יגיעו למפגש של כ -100%. בשלב זה ניתן לאמת את טוהר התרבית על ידי אימונוציטוכימיה. ניתן לשמור על התרבויות המשתפכות עד 7 ד' עד שתמשיך לשלב הבא. שנה מחצית של המדיום כל 3 ימים.
3. הכנת נוירונים ראשוניים בהיפוקמפוס
הערה: נוירונים ראשוניים בהיפוקמפוס של עכברים צריכים להיגזר מעוברים E15.5 - E16 של עכברות הרות מתוזמנות.
- הכינו נוירון בינוני (MEM עם 10 mM נתרן פירובט, 0.1% w/v ovalbumin, 2% v/v B27 תוספת בינונית, 0.1% v/v gentamicin (סטרילי מסונן)), ומדיום הכנה (HBSS עם 0.6% w/v גלוקוז ו 10mM HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazine ethanesulfonic acid)). חימום מראש ושיווי משקל מראש של תווך הנוירון בצלוחיות מסנן ב-37°C, 6% v/v CO2.
- הניחו את כיסויי הזכוכית (בקוטר 12 מ"מ) בבארות של 24 צלחות באר (השתמשו בכיסויים המיוחדים, המחורצים לשימוש עם תוספות תרבית תאים).
- מצפים לפחות שעה אחת עם 15 מיקרוגרם/מ"ל Poly-DL-Ornithine במים (בדרגת תרבית תאים) ב-37°C. יש להשתמש לפחות ב-500 μL לכל באר כדי להבטיח שהכיסויים מכוסים לחלוטין. לשטוף את הבארות פעמיים עם PBS. השאירו את PBS בבארות עד ציפוי התאים. ודא שהבארות אינן מתייבשות.
- כדי לנתח את ההיפוקמפי, להכין 3x 10 ס"מ כלים מלאים בינוני הכנה 1x 2 מ"ל צינור עם 1 מ"ל בינוני הכנה. מכינים מספריים ו-2 מלקחיים עדינים.
- להקריב את העכבר ההרה על ידי נקע צוואר הרחם, לעקר את הבטן על ידי שטיפה עם אתנול 70% v/v, ולפתוח את הבטן באמצעות מספריים חדים. הבלו את הרחם חרוזים בזהירות עם מספריים ולהעביר את האיבר לתוך 1x 10 ס"מ צלחת מלא בינוני הכנה.
- לאחר מכן, להסיר את העוברים מן הרחם. בזהירות לחתוך את הרחם ולהסיר את מי השפיר מבלי לפגוע בעוברים באמצעות 2 מלקחיים. לאחר מכן, ערפו את ראשו של כל עובר עם זוג מספריים והעבירו את הראשים לצלחת שנייה בקוטר 10 ס"מ המסופקת עם אמצעי הכנה.
- המשך בהכנת הראשים (בדומה להכנה המתוארת ב 1.4 - 1.7).
- לשתק את הראש עם זוג מלקחיים ולחתוך את הגולגולת והעור באזור הצוואר קרוב למוח האחורי, בניצב לעצב. השתמשו בזוג מלקחיים שני כדי להרים גם את הגולגולת וגם את כיסוי העור, וכופפו את כובע הגולגולת הרך לכיוון הקצה הרוסטרלי של הראש, ובכך חשפו את המוח.
- בעזרת 2 מלקחיים, לנתק את המוח מחלל הגולגולת. כדי לעשות זאת, סגור זוג אחד של מלקחיים והפרד את המוח מהגולגולת החל מנורות הריח ונע לכיוון המוח האחורי. אוספים את המוח בצלחת נוספת של 10 ס"מ מלאה במדיום הכנה.
- נתחו את ההיפוקמפוס מקליפת המוח כפי שתואר לעיל להכנת האסטרוציטים (שלב 1.6). הסר את ההיפוקמפוס מכל חצי כדור ולאסוף אותם בצינור 2 מ"ל מלא בינוני הכנה.
- לאחר השלמת הדיסקציה, להעביר את הצינור לספסל זרימה למינרית סטרילית ולעכל את רקמת ההיפוקמפוס עם 1 מ"ל פתרון העיכול המכיל פפאין. הכן את תמיסת העיכול כמתואר בשלב 1.9 - 1.10, אך השתמש ב- MEM במקום DMEM.
הערה: שלבים 3.9 - 3.12 הם קריטיים ויש להשלים אותם תוך 10 - 15 דקות.
- לאחר השלמת העיכול, בזהירות למשוך את פתרון העיכול על ידי יניקה עדינה עם פיפטה.
- שטפו את ההיפוקמפי 3 פעמים עם נוירון מדיום על ידי הוספה ברצף ולאחר מכן שאיפה זהירה של 1 מ"ל מדיום תרבית טרי לכל מחזור שטיפה. אין לבצע צנטריפוגה של מתלה התא.
- לאחר שלב הכביסה הסופי, בזהירות triturate את הרקמה ב 1 מ"ל נוירון בינוני.
- ספור את התאים באמצעות תא ספירה וצלחת 35,000 תאים בתווך נוירון 500 μL לכל באר אחת של צלחת 24 בארות (הצלחת המוזכרת ב 3.2).
הערה: לחלופין, aliquot התא יכול להיות מוכתם עם כחול טריפאן כדי להעריך את החיוניות של הכנת התא. שלוט בצפיפות הציפוי על ידי בדיקה חזותית באמצעות המיקרוסקופ (בדרך כלל 90 - 110 תאים לכל שדה ראייה של מטרה סטנדרטית פי 10).
- מקם נוירונים באינקובטור ב 37 ° C, 6% v/v CO2 במשך 1 שעות.
- לאחר הדגירה, הוציאו את התוספות המוכנות (שנזרעו עם חד-שכבות אסטרוציטים מתמזגות) מחוץ לאינקובטור (ראו שלב 2.8). החליפו את התווך על ידי שאיפת תווך האסטרוציטים והחלפתו בתווך נוירון טרי 500 μl.
הערה: התוספות צריכות להכיל מונושכבות אסטרוציטים קונפלואנטיות לאחר 2 - 3 DIV (ימים במבחנה).
- הניחו את התוספות עם אסטרוציטים בזהירות לתוך הבארות המכילות את תרביות הנוירונים (שלב 3.13) באמצעות מלקחיים סטריליים.
- מקם את תרבית הנוירון-אסטרוציטים העקיפה המתקבלת בחזרה לתוך האינקובטור ב 37 ° C, 6% v/v CO2.
הערה: בתנאים אלה, נוירונים ניתן לטפח עד 4 שבועות בתווך מוגדר לחלוטין. אין צורך בשינוי בינוני. עבור תרבויות ותיקות, מומלץ למלא בארות ריקות עם מים סטריליים על מנת להפחית את האידוי מן צלחת 24 בארות.
