כל ההליכים הכרוכים באיסוף דגימות בוצעו בהתאם להנחיות IRB של המכון.
1. דיסקציה מוחית של חולדה או עכבר
הערה: ניתן להשתמש גם בעכברים וגם בחולדות. ניתן להשתמש גם בבעלי חיים מעל P8 (בדקנו עד P12), אך הסרת קרומי המוח תהיה קשה יותר ויותר. יתר על כן, תנובת התאים ובריאותם יפחתו, מאחר שתאי מוח מבעלי חיים מבוגרים יותר יצרו תהליכים וקשרים מורכבים שעלולים להישבר במהלך דיסוציאציה של רקמות, מה שיוביל למוות תאי מוגבר. כאן מתוארים תכשירים קורטיקליים, אולם ניתן להשתמש גם באזורים אחרים במוח.
- יש להכניס 0.05% טריפסין-EDTA לאמבט מים בטמפרטורה 37°C.
- הרדימו בעלי חיים (חולדות הרות עבור גורי E19, או חיות P0-P8) על ידי העלאה איטית של ריכוזCO2, ובידוד המוח. השלבים הבאים דורשים טכניקה סטרילית.
- אם עובדים עם רקמה עוברית, תחילה להסיר את העוברים מן הרחם ולפתוח את השקים העובריים, ולאחר מכן מיד לחתוך את הראשים עם מספריים. כאשר כל הראשים נחתכים, מעבירים אותם למדיום דיסקציה מקורר מראש.
- ברגע שהראשים שקועים בתווך, פתחו את העור והגולגולת (שניהם רכים מאוד אצל בעלי חיים צעירים) בעזרת מלקחיים וצבטו את המוח הקטן. בזהירות למנף את שאר המוח למעלה והחוצה מהגולגולת.
הערה: שניים עד ארבעה עוברי E19 מניבים מספיק רקמה לשמונה לפחות מנות של אסטרוציטים קורטיקליים בקוטר 10 ס"מ המצופים ב-500,000 תאים לצלחת ביום הנתיחה.
- עבור גורים שזה עתה נולדו או מבוגרים יותר, חתכו את הראשים עם מספריים, ובודדו את המוח על ידי חיתוך העור בקו ישר מהחלק האחורי של הראש ועד קצה האף. משוך את העור הצידה וחתך בזהירות את הגולגולת ימינה ושמאלה, ואז הרם את עצם הגולגולת למעלה. לחתוך את המוח הקטן, ולמנף את שאר המוח למעלה והחוצה מהגולגולת.
הערה: שניים עד שלושה גורי P0-P8 מניבים מספיק רקמה לשמונה לפחות מנות של אסטרוציטים קורטיקליים בקוטר 10 ס"מ המצופים ב-500,000 תאים לצלחת ביום הנתיחה.
- הפרידו את קליפת המוח מהמבנה התחתון של המוח האמצעי. מקם את המלקחיים בתוך הסדק האורכי בין ההמיספרות, ואז העבר את המלקחיים בין קליפת המוח לבין מבני המוח התיכון של חצי כדור אחד (בניצב לסדק האורכי) כדי לצבוט כל חצי כדור חופשי.
- בעזרת המלקחיים, הסירו את כל קרומי המוח מכל חצי כדור (ומההיפוקמפוס שלו), ואז הפרידו את ההיפוקמפוס. אם יש צורך באסטרוציטים של ההיפוקמפוס, העבירו כל היפוקמפוס לתוך צינור של 15 מ"ל מלא בתווך דיסקציה של 14 מ"ל על קרח.
- הסירו אזורים נוספים מקליפת המוח של כל חצי כדור אם נדרשים אזורים מסוימים (למשל, קליפת המוח המצחית). חתכו כל רקמה קורטיקלית שתשמש ליצירת אסטרוציטים לחתיכות שגודלן אינו עולה על 1 מ"מ3. לאסוף את כל חתיכות רקמת קליפת המוח בצינור נפרד 15-mL מלא בתווך דיסקציה על קרח.
2. עיכול רקמות ודיסוציאציה
- לאחר שכל חתיכות הרקמה נאספות, לחכות שהם להתיישב לתחתית הצינור, ולאחר מכן לשאוף מדיום ככל האפשר.
- הוסף 2-3 מ"ל של 0.05% טריפסין-EDTA באמצעות פיפטה סרולוגית, ודגר על הצינורות באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.
הערה: שחררו את כל הטריפסין-EDTA מהפיפטה במהירות כדי לערבב את חתיכות הרקמה ולאפשר להן לשקוע שוב.
- בזהירות לשאוף את טריפסין-EDTA, משאיר חתיכות רקמה נוזל קטן ככל האפשר, בחלק התחתון של הצינור.
- הוסף 5 מ"ל של אמצעי דיסקציה מקורר מראש כדי לשטוף את יתרת טריפסין-EDTA. פיפטה לצד החלק העליון של הצינור כדי להשיג ערבוב של חתיכות הרקמה.
- שאפו את מדיום הדיסקציה, והשאירו את חלקי הרקמה בכמה שפחות נוזלים. חזור על שלב הכביסה עם אמצעי דיסקציה מקורר מראש פעמיים נוספות.
- לאחר שלב השטיפה הסופי, הוסף 1 מ"ל DMEM+ (מחומם לטמפרטורת החדר) באמצעות קצה פיפטה של 1,000 μL, וטריטורציה של הרקמה על ידי פיטום למעלה ולמטה מבלי להכניס בועות.
הערה: חשוב להימנע מייצור בועות, שכן זה עשוי לשנות את ה- pH של התמיסה, אשר אסטרוציטים רגישים למדי.
- הניחו מסננת תאים של 100 מיקרומטר בפתח צינור של 50 מ"ל והרטיבו מראש את המסנן עם 4.5 מ"ל של DMEM+ מקורר מראש.
- פיפטה 1 מ"ל של תרחיף רקמות מנותק על מסננת התא ולהוסיף עוד 4.5 מ"ל DMEM+ מקורר מראש כדי לשטוף את התאים דרך מסננת התא.
3. העברת תאים
- יום לפני המעבר, ציפוי צלחות תרבית תאים עם 0.04% PEI.
- ביום במבחנה (DIV) 7 לאחר הנתיחה, מניחים את הכלים בקוטר 10 ס"מ עם תאים ב- DMEM+ על שייקר מעבדה באינקובטור ומנערים את הכלים במהירות 110 סל"ד למשך 6 שעות.
- יש לשטוף את ה-PEI מכיסויים מצופים במים מזוקקים שעברו דה-יוניזציה פעמיים. הוסף מדיום NB+H לצלחות (500 מיקרוליטר לבאר עבור צלחות של 24 בארות ו-2 מ"ל לבאר עבור צלחות של 6 בארות). יש לאזן מראש את הצלחות באינקובטור בטמפרטורה של 37°C ו-5%CO2 בזמן שהכלים בקוטר 10 ס"מ רועדים, או למשך 30 דקות לפחות.
- 20-30 דקות לפני תום 6 שעות הרעידה, טרום חם 1x PBS, DMEM+, NB+H, ו 0.25% טריפסין-EDTA עד 37 ° C באמבט המים.
- לאחר 6 שעות של ניעור, הסירו את כלי התרבית מהשייקר והחליפו מיד את המדיום (המכיל נוירונים מזועזעים, אוליגודנדרוציטים ומיקרוגליה) ב-10 מ"ל שחומם מראש 1x PBS לכל מנה.
הערה: חשוב לשאוף מיד את התווך הישן המכיל תאים מנותקים כדי למנוע חיבור מחדש של תאים שאינם אסטרוציטים.
- הסר את PBS ולהוסיף 3 מ"ל טריפסין-EDTA שחומם מראש לכל מנה. יש לדגור על כל מנה במשך 4 דקות באינקובטור בטמפרטורה של 37°C ו-5%CO2
- הוסף 5 מ"ל DMEM+ שחומם מראש ל- 3 מ"ל טריפסין-EDTA בכל צלחת, פיפטה את התאים מהצלחת באמצעות פיפטה סרולוגית 5 מ"ל, ולאסוף את תרחיף התאים בצינור 50 מ"ל.
הערה: פיפטה ישירות מתחתית המנה - רצפת המנה צריכה להיות ברורה יותר ככל שהתאים מתנתקים. יש להשתמש רק בתווך המכיל סרום (במקום DMEM+), מכיוון שהסרום אינו פעיל טריפסין.
- צנטריפוגה את מתלה התא ב 3,220 x גרם ב 20 ° C למשך 4 דקות.
- הסר את supernatant ו resuspend את גלולת התא ב 1 מ"ל שחומם מראש NB+H.
4. ציפוי תאים לתרביות אסטרוציטים סופיות
- ספור את התאים.
- צלחת 20,000 תאים לבאר בצלחות 6 בארות (ב 2 מ"ל NB + H בינוני לכל באר) או 5,000 תאים לבאר בלוחות 24 באר (ב 500 מיקרוליטר NB+H בינוני לכל באר).
- שמור את תרביות התאים באינקובטור ב 37 ° C ו 5% CO2 עד טיפול נוסף או ניתוח.
