$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
כל ההליכים הכרוכים באיסוף דגימות בוצעו בהתאם להנחיות IRB של המכון.
1. הבחנה של hiPSCs חיוביים rtTA/Ngn2 לנוירונים על גבי 6-well MEAs ו-Glass Coverslips
הערה: בפרוטוקול זה, הפרטים מסופקים עבור הבחנה בין hiPSCs חיוביים rtTA / Ngn2 על שני מצעים שונים, כלומר MEAs של 6 בארות (התקנים המורכבים מ -6 בארות עצמאיות עם 9 הקלטה ומיקרואלקטרודות משובצות ייחוס אחת לכל באר) וכיסויי זכוכית בבארות של צלחת בת 24 בארות. עם זאת, ניתן להתאים את הפרוטוקולים בקלות למצעים גדולים יותר (למשל, לבארות של לוחות של 12 או 6 בארות), על ידי הגדלת הערכים שהוזכרו בהתאם לשטח הפנים.
- הכינו את ה-MEAs או כיסויי הזכוכית (יום 0 ויום 1)
- יום לפני תחילת הבידול, יש לעקר את ה-MEAs בהתאם להמלצת היצרן.
- לדלל את חלבון ההדבקה Poly-L-Ornithine (אש"ף) במים סטריליים אולטרה-טהורים לריכוז סופי 50 מיקרוגרם/מ"ל. צפו את אזור האלקטרודות הפעילות של 6 בארות MEAs על ידי הנחת טיפה של 100 μL של אש"ף מדולל בכל באר. מניחים את הכיסויים בבארות של צלחת 24 בארות באמצעות פינצטה סטרילית. מוסיפים 800 μL של אש"ף מדולל בכל באר. מנעו מהכיסויים לצוף על ידי דחיפתם כלפי מטה עם קצה פיפטה של 1000 μL.
- לדגור על 6 בארות MEAs ו 24 בארות צלחת O/N באינקובטור לח 37 ° C עם אטמוספירה של 5% CO2. למחרת, שאפו אש"ף המדולל. שטפו את משטחי הזכוכית של 6 בארות MEAs ואת הכיסויים פעמיים עם מים סטריליים טהורים במיוחד.
- יש לדלל למינין ב-DMEM/F12 קר לריכוז סופי של 20 מיקרוגרם/מ"ל (עבור 6 בארות MEAs) ו-10 מיקרוגרם/מ"ל (עבור כיסויי הזכוכית). צפו מיד את אזור האלקטרודות הפעילות של 6 בארות MEAs על ידי הצבת טיפה של 100 μL בכל באר. באופן דומה, הוסיפו 400 μL של הלמינין המדולל בכל באר של צלחת 24 בארות כדי לצפות את הכיסויים. מנעו מהכיסויים לצוף על ידי דחיפתם כלפי מטה עם קצה פיפטה של 1,000 מיקרוליטר.
- לדגור את 6-בארות MEAs ו 24 צלחת באר באינקובטור לח 37 ° C עם אטמוספירה של 5% CO2 לפחות 2 שעות.
- צלחת hiPSCs (יום 1)
הערה: הכרכים המוזכרים בשלבים 3.2.1 - 3.2.4 מניחים כי hiPSCs חיוביים rtTA / Ngn2 מתורבתים בצלחת של 6 בארות וכי התאים של באר אחת נקצרים. הנפחים הנדרשים לציפוי התאים ב-MEAs של 6 בארות ו/או בכיסויים תלויים במספר ה-MEAs של 6 בארות ו/או במספר הכיסויים המשמשים בניסוי; המספרים שצוינו בשלבים 3.2.6 - 3.2.8 מאפשרים שינוי קנה מידה לגדלי ניסוי שונים.
- חם DMEM/F12, CDS ו-E8 בינוני עם 1% (v/v) פניצילין/סטרפטומיצין ל-R/T. הוסף דוקסיציקלין לריכוז סופי של 4 מק"ג/מ"ל ומעכב ROCK למדיום E8.
- שאפו את המדיום המושקע של hiPSCs חיוביים rtTA / Ngn2 והוסיפו 1 מ"ל CDS ל- hiPSCs. דגירה 3 - 5 דקות באינקובטור לח 37 מעלות צלזיוס עם אטמוספירה של 5% CO2. בדקו תחת המיקרוסקופ אם התאים מתנתקים זה מזה.
- מוסיפים 2 מ"ל DMEM/F12 לבאר, מרחפים בעדינות את התאים עם פיפטה של 1,000 מיקרוליטר ומעבירים את התאים לצינור של 15 מ"ל. הוסף 7 מ"ל DMEM/F12 לתרחיף התא. סובב את התאים ב 200 x גרם במשך 5 דקות.
- שואפים את הסופרנאטנט ומוסיפים 2 מ"ל של מדיום E8 מוכן. נתק את hiPSCs על ידי הצבת קצה פיפטה של 1,000 μL בצד של צינור 15 מ"ל והשעיה מחדש של התאים בעדינות. בדוק תחת המיקרוסקופ אם התאים מנותקים.
- קבע את מספר התאים (תאים/מ"ל) באמצעות תא המוציטומטר.
הערה: צלחת 6 בארות במפגש של 80 - 90% תניב בדרך כלל 3.0 - 4.0 x 106 תאים בסך הכל.
- שאפו את הלמינין המדולל. עבור MEAs 6-well, לדלל את התאים כדי לקבל תרחיף תאים של 7.5 x 105 תאים / מ"ל. לוחית את התאים על ידי הוספת טיפה של 100 μL של תרחיף התא על אזור האלקטרודה הפעילה בכל באר של 6-באר MEAs. עבור הכיסויים, לדלל את התאים כדי לקבל תרחיף תאים של 4.0 x 104 תאים / מ"ל. לוחית את התאים על ידי הוספת 500 μL של תרחיף התא לבארות של צלחת 24 בארות.
הערה: צפיפות התאים הסופית ב-MEAs גבוהה יותר מאשר בכיסויים (איור 1A ו-B). מצאנו שצפיפות תאים גבוהה זו נדרשה כדי לתעד כראוי את פעילות הרשת. בפרוטוקול, המספרים מסופקים שהיו אופטימליים עבור הבדיקות.
- הניחו את צלחת 6 בארות MEA וצלחת 24 בארות באינקובטור לח של 37 מעלות צלזיוס עם אטמוספירה של 5% CO2 למשך שעתיים (MEAs) או O/N (צלחת 24 בארות).
- לאחר שעתיים, הוסף בזהירות 500 μL של מדיום E8 מוכן לכל באר של 6-well MEAs. מקם את 6-well MEAs O/N באינקובטור לח 37 ° C עם אטמוספירה של 5% CO2.
- שינוי המדיום (יום 2)
- למחרת, הכינו DMEM/F12 עם 1% (v/v) תוסף N-2, 1% (v/v) חומצות אמינו לא חיוניות, ו-1% (v/v) פניצילין/סטרפטומיצין. הוסף נוירוטרופין-3 רקומביננטי אנושי (NT-3) לריכוז סופי של 10 ננוגרם/מ"ל, גורם נוירוטרופי רקומביננטי אנושי (BDNF) לריכוז סופי של 10 ננוגרם/מ"ל, ודוקסיציקלין לריכוז סופי של 4 מיקרוגרם/מ"ל. מחממים את המדיום ל 37 מעלות צלזיוס.
- מוסיפים למינין לריכוז סופי של 0.2 מק"ג/מ"ל למדיום. סנן את המדיום שנוצר. שאפו את המדיום המשומש מהבארות של 6 בארות MEAs ואת צלחת 24 בארות ולהחליף אותו עם המדיום מוכן. לדגור על 6 בארות MEAs ו 24 בארות צלחת O/N באינקובטור לח 37 ° C עם אטמוספירה של 5% CO2.
- הוסף אסטרוציטים של חולדות (יום 3)
הערה: הכרכים המוזכרים בפרוטוקול זה מניחים שהאסטרוציטים של החולדות מתורבתים בצלוחיות תרבית T75. זה קריטי שהאסטרוציטים של החולדות שמתווספים לתרביות יהיו באיכות טובה. אנו משתמשים בשני קריטריונים כדי לבדוק אם אסטרוציטים של חולדות הם באיכות טובה. ראשית, תרבית האסטרוציטים של החולדות אמורה להיות מסוגלת לגדול באופן שוטף בתוך עשרה ימים לאחר הבידוד ממוחות העוברים של החולדה. שנית, לאחר פיצול תרבית האסטרוציטים של החולדות, אסטרוציטים של חולדות אמורים להיות מסוגלים ליצור שכבה חד-שכבתית מתמזגת (איור 1C). אם תרבית אסטרוציטים של חולדות אינה עומדת בשני קריטריונים אלה, אנו ממליצים לא להשתמש בתרבית זו לניסויי התמיינות (differentiation).
- חם 0.05% טריפסין-EDTA ל RT. לחמם את DPBS ו DMEM / F12 עם 1% (v/v) פניצילין/סטרפטומיצין ל 37 ° C.
- שאפו את המדיום המושקע של תרבית אסטרוציטים חולדה. שטפו את התרבית על ידי הוספת 5 מ"ל DPBS וסחפו אותה בעדינות.
- שאפו את DPBS והוסיפו 5 מ"ל 0.05% טריפסין-EDTA. מרחו את הטריפסין-EDTA סביב בעדינות. דגירה באינקובטור לח של 37 מעלות צלזיוס עם אטמוספירה של 5% CO2 למשך 5 - 10 דקות.
- בדקו תחת המיקרוסקופ אם התאים מנותקים. נתק את התאים האחרונים על ידי פגיעה בבקבוק כמה פעמים.
- הוסף 5 מ"ל DMEM/F12 לצלוחית. Triturate את התאים בעדינות בתוך הבקבוק עם פיפטה 10 מ"ל. לאסוף את השעיית התא בצינור 15 מ"ל. סובב את הצינור ב 200 x גרם במשך 8 דקות.
- שאפו את הסופרנאטנט והשעו מחדש את התאים ב-1 מ"ל של DMEM/F12. קבע את מספר התאים (תאים/מ"ל) באמצעות תא המוציטומטר.
- הוסף 7.5 x 104 אסטרוציטים לכל באר של 6 בארות MEAs. הוסף 2.0 x 104 אסטרוציטים לכל באר של צלחת 24 באר. דגרו על MEAs ועל צלחת 24 בארות O/N באינקובטור לח של 37 מעלות צלזיוס עם אטמוספירה של 5% CO2.
- שינוי המדיום (יום 4)
- הכינו מדיום נוירובזאלי עם תוסף B-27 (v/v), 1% (v/v) L-alanyl-L-גלוטמין ו-1% (v/v) פניצילין/סטרפטומיצין. הוסף NT-3 לריכוז סופי של 10 ננוגרם/מ"ל, BDNF לריכוז סופי של 10 ננוגרם/מ"ל, ודוקסיציקלין לריכוז סופי של 4 מיקרוגרם/מ"ל. בנוסף, להוסיף ציטוזין β-D-arabinofuranoside לריכוז של 2 μM.
הערה: ציטוזין β-D-arabinofuranoside מתווסף למדיום כדי לעכב התפשטות אסטרוציטים ולהרוג את שאר hiPSCs שאינם מתמיינים לנוירונים.
- סנן את המדיום וחם ל 37 ° C. לשאוף את המדיום בילה מן הבארות של 6 בארות MEAs ואת צלחת 24 בארות ולהחליף אותו עם המדיום מוכן. שמור על 6-well MEAs ואת צלחת 24-well באינקובטור לח 37 ° C עם אטמוספירה של 5% CO2.
- רענן את המדיום (יום 6 - 28)
הערה: החל מהיום השישי, רענן חצי מהמדיום כל יומיים. מהיום ה-10 ואילך, המדיום מתווסף ל-FBS כדי לתמוך בכדאיות האסטרוציטים.
- הכינו מדיום נוירובזאלי עם 2% (v/v) תוסף B-27, 1% (v/v) L-alanyl-L-גלוטמין, ו-1% (v/v) פניצילין/סטרפטומיצין. הוסף NT-3 לריכוז סופי של 10 ננוגרם/מ"ל, BDNF לריכוז סופי של 10 ננוגרם/מ"ל, ודוקסיציקלין לריכוז סופי של 4 מיקרוגרם/מ"ל. מהיום העשירי ואילך, גם להשלים את המדיום עם 2.5% (v/v) FBS. סנן את המדיום המתקבל ולחמם אותו ל 37 ° C.
- הסר מחצית המדיום המשומש מהבארות של 6 בארות MEAs ואת צלחת 24 בארות באמצעות פיפטה 1000 μL ולהחליף אותו עם המדיום מוכן. שמור על 6-well MEAs ואת צלחת 24-well באינקובטור לח 37 ° C עם אטמוספירה של 5% CO2.
