$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.
1. הכנת כדורי נוירונים כתרבית טיפה תלויה (ימים במבחנה (DIV) 0-3)
הערה: ההליכים המתוארים כאן להכנת תרבית כדורי נוירונים מבוססים על השיטה שדווחה בעבר על ידי קבוצת סאסאקי עם כמה שינויים. כמו כן, אימצנו מספר נהלים משיטת הבנקאים לתרבות מנותקת.
- אישור הדברים הבאים לפני תחילת הדיסקציה
- הכינו מראש את כל הפתרונות הנדרשים ועיקרו אותם על ידי אוטוקלאב/סינון.
- הכינו את כל המכשירים והחומרים שישמשו בכל שלב בתרבית נוירונים קליפת המוח הזו.
- רססו ונגבו את ארון זרימת האוויר הלמינרי, שולחן הנתיחה, צלחת הבמה של סטריאומיקרוסקופ, מספריים ומלקחיים באתנול 70%.
- יש להרדים את העכבר עם מריחתCO2 ולנתח את הבטן כדי לקבל עוברי E16.
- הסר את המוח מהעוברים בזהירות בעזרת קצוות עדינים של מלקחיים והעבר אותם לצלחות תרבית תאים 60 מ"מ המכילות 4 מ"ל של 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic חומצה, תמיסת מלח חוצצת HEPES (HBSS).
הערה: מדיום הדיסקציה HBSS מכיל 10 mM HEPES (pH 7.4), 140 mM נתרן כלורי (NaCl), 5.4 mM אשלגן כלורי (KCl), 1.09 mM די-נתרן מימן פוספט (Na2HPO4), 1.1 mM אשלגן דימימן פוספט (KH2PO4), 5.6 mM D-גלוקוז, ו 5.64 מיקרומטר פנול אדום.
- מוציאים את הקרקפת, חותכים את פקעת הריח, מפרידים את קליפות המוח מכל חצי כדור מוח באמצעות קצוות עדינים של מלקחיים תחת סטריאומיקרוסקופ, ומעבירים לצלחות 60 מ"מ נוספות המכילות HBSS טרי. השתמש לפחות 3-5 עוברים עבור כל תרבית כדור נוירון נפרדת.
- חותכים את קליפות המוח לחתיכות קטנות עם מספריים קפיציים microdissecting במכסה מנוע תרבית תא זרימה למינרית.
- להעביר קליפות טחון לצינור 15 מ"ל וטריפסין את קליפת המוח הטחונה ב 4 מ"ל של 0.125% טריפסין ב HBSS במשך 4.5 דקות באמבט מים ב 37 ° C.
הערה: זמן טריפסיניזציה זה הוא קריטי לתרבית נוירונים יעילה, שכן הזמן הגדל (> 4.5 דקות) מוביל להרבה יותר תאי עצב מתים.
- מעבירים את צברי התאים לצינור חדש של 15 מ"ל המכיל 10 מ"ל HBSS על ידי פיפטת העברה סטרילית ודגרים ב-37°C למשך 5 דקות. חזור על שלב זה פעם נוספת.
- העבירו את צברי התאים לצינור חדש של 15 מ"ל המכיל 2 מ"ל של מדיה נוירובזאלית המכילה GlutaMax, תוסף B27 (NGB בינוני), 0.01% DNase I ו-10% נסיוב סוסים.
- שלשו את קליפות המוח שעברו טריפסינציה על ידי הדבקתן מעלה ומטה שוב ושוב (3-5 פעמים) באמצעות פיפטה פסטר מזכוכית מלוטשת אש.
הערה: קוטר פיפטת פסטר זכוכית משובחת מלוטשת באש חשוב מאוד כמתואר בנייר שיטת בנקאי. אם הפיפטה צרה מכדי לעבור קליפת המוח, הכינו פיפטות בעלות 2-3 גדלים שונים, ונסו מפיפטה גדולה יותר.
- להכנת כדורי נוירונים, קח את תרחיף התאים לעיל והתאם את צפיפות התא ל 1 x 106 תאים / מ"ל באמצעות מדיום NGB.
- תרבית את תאי העצב בקליפת המוח כטיפות תלויות המכילות 10,000 תאים/טיפה (טיפה אחת היא 10 מיקרוליטר) בתוך העפעפיים העליונים של כלי תרבית בקוטר 10 ס"מ.
- הוסף 7 מ"ל של מלוחים חוצצי פוספט (PBS) לחלק התחתון של צלחות תרבית, ולאחר מכן לשמור באינקובטור במשך 3 ימים ב 37 ° C עם 5% CO2 בתנאים לחים כדי לאפשר היווצרות כדור נוירון.