$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. הכנת תרבית גנגליון שורש גבי בוגר מנותק נוירון או נוירון DRG
- לפני הגדרת התרבות, מצפים מראש צלחת 6 בארות עם poly-D-ליזין ולמינין. יש לדגור על צלחת בעלת 6 בארות עם 0.01% פולי-D-ליזין בטמפרטורה של 37°C למשך שעתיים או ב-4°C למשך הלילה. לאחר מכן, לשטוף את הצלחת פעמיים עם מים מזוקקים.
- דוגרים על הצלחת בתמיסת למינין בריכוז של 3 מק"ג/מ"ל למשך שעתיים בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן שוטפים את הצלחת פעמיים במים מזוקקים. יבשו את הצלחת בטמפרטורת החדר למשך שעה לפחות.
- הרדימו עכבר בתא CO2 שקוף המחובר לבלון גז CO2 דחוס. חתכו את העור שמעל עמוד השדרה עם להב כירורגי ונתחו את השרירים הפרא-חולייתיים באופן דו-צדדי כדי לחשוף את עצמות החוליות. הסר את עצמות החוליות בקפדנות באמצעות רונגר כירורגי צר עד לחשיפה מלאה של ה- DRGs.
הערה: נוירוני DRG בוגרים מתקבלים מעכברים זכרים בוגרים C57BL6 בגילאי 8 שבועות עד 12 שבועות.
- הסר את ה- DRGs באופן דו-צדדי מה- S1 עד לרמת C1 באמצעות מספריים לכריתת קשתית ומלקחיים עדינים תחת מיקרוסקופ מנתח. נסו לחתוך את השורשים לחלוטין מ- DRGs על מנת למזער את הזיהום של תאי Schwann או פיברובלסטים.
- אחסנו את ה-DRGs המנותחים בצלחת פטרי בקוטר 60 מ"מ המכילה 5 מ"ל של מדיום הנשר המעובד של דולבקו (DMEM) על קרח עד שכל ה-DRGs יהיו השלב הבא, גם אם עדיין נאספים DRGs שנותרו.
הערה: זה קריטי לנתח את DRGs מהר ככל האפשר. איסוף כל ה- DRGs מעכבר אחד לא אמור להימשך יותר מ -30 דקות. 30 דקות לאחר המתת החסד, להפסיק לאסוף את DRGs ולהמשיך להעביר את DRGs לצינור אפנדורף 1.5 מ"ל באמצעות קצה פיפטה כחול (1000 μL) עם קצה חתך. הסר את ה- DMEM לאחר סיבוב מהיר למשך מספר שניות באמצעות מיני צנטריפוגה. הוסף 1 מ"ל DMEM המכיל 125 U/mL סוג XI collagenase ודגור על הצינור במשך 90 דקות עם סיבוב עדין (35-40 סל"ד) באמצעות שייקר טוויסטר באינקובטור 37 מעלות צלזיוס. יש לשתק את הצינור על רצפת השייקר באמצעות סרט הדבק.
- יש להשליך DMEM המכיל collagenase ולהוסיף 1 מ"ל DMEM טרי. המתן עד שה- DRG הצפים ישקעו לחלוטין לתחתית, ולאחר מכן הסר את ה- DMEM עם פסולת הרקמות. חזור על שלב כביסה זה לפחות שש פעמים.
הערה: אל תנסו להשליך את הסופרנאטנט לחלוטין. היזהר לא להסיר DRGs עם DMEM supernatant.
- מעבירים את ה-DRGs לצינור חרוטי של 15 מ"ל באמצעות קצה פיפטה כחול (1000 μL) עם קצה חתך. לאחר מכן פיפטה מעלה ומטה בעדינות לפחות 15 פעמים באמצעות קצה כחול (1000 μL) כדי ליצור תרחיף תאים הומוגני. הימנעו מיצירת בועות ונסו לא לגעת בתחתית הצינור החרוטי עם קצה פיפטה.
- צנטריפוגה את הצינור ב 239 x גרם במשך 3 דקות בזהירות להשליך את supernatant עם פסולת צפה. הוסף 1 מ"ל של מדיום נוירובזאלי בתוספת B27 (2.0% v/v) והשהה מחדש את גלולת התא על ידי פיפטציה עדינה למעלה ולמטה 5 עד 10 פעמים.
- העבירו את מתלה התא דרך מסננת תאים של 70 מיקרומטר המונחת על גבי צינור חרוטי של 50 מ"ל. המתן 2 דקות, ולאחר מכן לשפוך Neurobasal/B-27 בינוני על המסננת באמצעות בקר פיפטה.
- צלחת כל נוירוני DRG שנאספו (בערך 2 x 106 נוירוני DRG מעכבר אחד) על שתי בארות של צלחת 6 בארות. נוירוני DRG של עכבר בוגר אחד מכסים שתי בארות בצלחת בעלת 6 בארות. לאחר מכן הניחו את הצלחת באינקובטורCO2 בטמפרטורה של 37°C עד לתרביות המקרופאגים.
2. תרבית משותפת של מקרופאגים פריטוניאליים ראשוניים על תוספת תרבית תאים
הערה: קבע את התרביות המשותפות 4 שעות לאחר הציפוי הראשוני של נוירוני DRG מנותקים
- מקרופאגים ראשוניים של הצפק מוכנים מעכברים זכרים בוגרים C57BL6 בגילאי 8 שבועות עד 12 שבועות. הרדימו בעל חיים בתא CO2. חותכים את עור הבטן בעדינות, חושפים את הצפק ונמנעים מחיתוך הצפק כדי למנוע דליפה של נוזל שטיפה.
- נקב את הצפק באמצעות מזרק עם מחט 22G והזריק 10 מ"ל של מלוחים חוצצים פוספט קר כקרח (PBS) לתוך חלל הצפק. עסו בעדינות את הצפק במשך 1-2 דקות. לאחר מכן, משוך את המחט וסחט את PBS דרך אתר ניקוב המחט, ולאסוף את נוזל השטיפה בצינור חרוטי 50 מ"ל.
הערה: לפני השימוש, לשים את המזרק על קרח כדי לשמור על הקור של PBS.
- צנטריפוגה את נוזל השטיפה ב 239 x גרם במשך 10 דקות ב 4 ° C כדי לגלול את רכיבי התאים. השהה מחדש את הגלולה עם 3 מ"ל של חיץ הליזה של תאי הדם האדומים (RBC) למשך 3 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן צנטריפוגה את מתלה התא שוב ב 239 x גרם במשך 10 דקות ב 4 ° C. להשעות מחדש את הגלולה עם 3 מ"ל של PBS ולצנטריפוגה את השעיית התא שוב כדי להסיר כל חיץ RBC lysis שנותר.
הערה: ודא שמאגר הליזיס של RBC הוסר לחלוטין. אחרת, חיץ RBC ליזיס שנותר עלול להיות רעיל למקרופאגים בתרבית.
- להשעות מחדש את התאים כדוריים ב 1 מ"ל של Neurobasal/B-27 בינוני. צלחת מחצית מכל המקרופאגים שנאספו (סה"כ 3 × 106 עד 6 x 106 תאים) על תוספת תרבית תאים עם שטח יעיל של 4.2 ס"מ2, אשר ממוקם על גבי הבאר של DRG.
הערה: במהלך תקופת התרבית המשותפת, מקרופאגים גדלים בתווך תרבית הנוירונים Neurobasal/B-27. הישרדות נאותה של מקרופאגים במצב זה אושרה.
3. טיפול ב-db-cAMP (dibutyryl-cyclic AMP) ואיסוף מקרופאגים CM
הערה: התחל טיפול db-cAMP 4 שעות לאחר תרביות משותפות נוירון-מקרופאגים.
- הוסף 2 μL של 100 μM db-cAMP פתרון לתרביות הנוירון-מקרופאגים. הוסף את אותו נפח של PBS עבור ניסוי בקרה.
- לאחר 24 שעות, ממלאים באר ריקה עם 1 מ"ל של מדיום תרבית מקרופאגים באותה צלחת 6 בארות. העבירו את תרבית התא המוחדרת בתרביות הנוירון-מקרופאגים לבאר הריקה בעזרת מדיום תרבית מקרופאגים. שמור את התאים באותו מצב במשך 72 שעות מבלי לשנות את המדיום.
הערה: אנו מוסיפים רק 1 מ"ל של מדיום תרבית מקרופאגים במהלך איסוף CM כדי ליצור CM מרוכז. במהלך איסוף CM, במידת הצורך, הוספנו עוד כדי לכסות לחלוטין את המקרופאגים בתוך העלון.
- לאחר 72 שעות, צנטריפוגו את המקרופאגים CM ב 239 x גרם במשך 5 דקות כדי להסיר את רכיבי התא. העבירו את הסופרנאטנט דרך מסנן של 0.2 מיקרומטר כדי להסיר את שאריות הפסולת התאית. יש לאחסן את ה-CM שנאסף בטמפרטורה של -70°C עד לשימוש.