שימוש בתווך מותנה מקרופאגים לקידום הרחבות נוירונים

תקציר

מקור: Yun, H. J., et al. תרביות משותפות של נוירון-מקרופאגים להפעלת מקרופאגים המפרישים גורמים מולקולריים עם פעילות צמיחת נוירוט. J. Vis. Exp. (2018).

סרטון זה מדגים בדיקה לקידום הצמיחה של הקרנות נוירונים הידועות כצמיחת נוירונים באמצעות המדיום המותנה במקרופאגים. תרבית משותפת של תאי עצב ומקרופאגים עם cAMP וקצירת התווך המותנה שמקורו במקרופאגים. גידול הנוירונים עם המדיום המותנה מקדם גידולים עצביים. גידולים אלה מסומנים באופן פלואורסצנטי ומדגימים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

פרוטוקול

1. טיפול ב-db-camp ואיסוף מדיום מותנה מקרופאגים

הערה: התחל טיפול db-cAMP 4 שעות לאחר תרביות הנוירון-מקרופאגים.

1. הוסף 2 μL של 100 μM dibutyryl cyclic AMP (db-cAMP) פתרון לתרביות הקו-וירוס נוירון-מקרופאגים. הוסף את אותו נפח של סאלין חוצץ פוספט (PBS) לניסוי בקרה.
2. לאחר 24 שעות, ממלאים באר ריקה עם 1 מ"ל של מדיום תרבית מקרופאגים באותה צלחת 6 בארות. העבירו את תרבית התא המוחדרת בתרביות הנוירון-מקרופאגים לבאר הריקה עם מדיום תרבית המקרופאגים. שמור את התאים באותו מצב במשך 72 שעות מבלי לשנות את המדיום.
   הערה: אנו מוסיפים רק 1 מ"ל של מדיום תרבית מקרופאגים במהלך איסוף מדיום מותנה (CM) כדי ליצור CM מרוכז. במהלך איסוף CM, במידת הצורך, הוספנו עוד כדי לכסות לחלוטין את המקרופאגים בתוך העלון.
3. לאחר 72 שעות, צנטריפוגו את המקרופאגים CM ב 239 x גרם במשך 5 דקות כדי להסיר את רכיבי התא. העבירו את הסופרנאטנט דרך מסנן של 0.2 מיקרומטר כדי להסיר את שאריות הפסולת התאית. יש לאחסן את ה-CM שנאסף בטמפרטורה של -70°C עד לשימוש.

2. בדיקת צמיחת עצבים עם CM שנאסף

1. לפני הקמת תרבית נוירונים נפרדת של DRG למבוגרים, יש לצפות מראש מגלשה בעלת 8 בארות בפולי-D-ליזין ולמינין. יש לדגור על צלחת בעלת 6 בארות עם 0.01% פולי-D-ליזין בטמפרטורה של 37°C למשך שעתיים או ב-4°C למשך הלילה. לאחר מכן, לשטוף את הצלחת פעמיים עם מים מזוקקים.
2. דוגרים על הצלחת בתמיסת למינין בריכוז של 3 מק"ג/מ"ל למשך שעתיים בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן שוטפים את הצלחת פעמיים במים מזוקקים. יבשו את הצלחת בטמפרטורת החדר למשך שעה לפחות.
3. השג נוירוני DRG בוגרים מנותקים בתווך נוירובזאלי בתוספת B27. צלחת 5 x 10⁴ תאים לכל באר על שקופית תא 8 מצופה מראש.
4. מקם את שקופית התא באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס למשך שעתיים, ומאפשר לתאים להתחבר לתחתית. לאחר מכן, להחליף את המדיום תרבית עם CM מופשר כי הוא מחומם מראש ב 37 ° C.
   הערה: היזהר לא לגעת בתחתית שקופית התא 8 בארות בעת הסרת מדיום התרבות והוספת CM שנאסף.
5. 15 שעות לאחר הציפוי הראשוני, להסיר את המדיום ולשטוף את התאים עם PBS פעם אחת. לאחר מכן, הוסף 200 μL של תמיסת פרפורמלדהיד 4% קרה כקרח לבארות, ודגר על התאים עם תמיסת paraformaldehyde במשך 20 דקות ב 4 ° C
   הערה: תרבית תאי העצב DRG עבור בדיקת צמיחת עצבים צריכה להיות מוגבלת במדויק ל -15 שעות. במצב זה, אין צמיחה עצבית ניכרת.
6. יש לשטוף שלוש פעמים עם PBS קר כקרח ולאחר מכן לבצע חסימה עם 10% סרום עיזים רגיל (NGS) עם 0.1% Triton-X במשך 30 דקות. לדגור על התאים הקבועים עם תמיסת נוגדנים ראשונית (anti-Tuj-1) מדוללת עם 10% NGS (בריכוז של 1 מיקרוגרם / מ"ל) במשך 4 שעות בטמפרטורת החדר או לילה ב 4 ° C.
7. שטפו שלוש פעמים עם PBS, ולאחר מכן דגרו על התאים עם תמיסת נוגדנים משנית (עז-אנטי עכבר) במשך שעתיים בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, שטפו פעמיים עם PBS והרכיבו את שקופית התרבית עם כיסוי (24 × 50 מ"מ) באמצעות פתרון הרכבה.
8. צלמו תמונות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי להמחיש צמיחת נוירונים (איור 1).

תוצאות

איור 1: תוצאות מייצגות של בדיקת צמיחת עצבים באמצעות מדיום מותנה המתקבל ממצבים שונים. (א, ב) נוירוני DRG בוגרים נותקו בצורה חריפה וגודלו בתרבית במשך 15 שעות בלבד. שעתיים לאחר הציפוי, מדיום התרבית הוחלף בתווך מותנה (CM) שהתקבל מתרביות משותפות של נוירונים-מקרופאגים שטופלו ב-PBS (A) או בדיבוטיריל cAMP (db-cAMP) (B). רק CM שטופל עם db-cAMP הציג פעילות חזקה של צמיחת נוירוט. (ג, ד) CM שהתקבל מתרביות המורכבו...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
תרבית תאים להוסיף קרום PET שקוף 0.4μm גודל נקבוביות	קורנינג,פלקון	353090	קרום PET שקוף בגודל נקבוביות של 0.4 מיקרומטר, לצלחת בעלת 6 בארות
מסננת תאי ניילון 70 מיקרומטר	קורנינג, פלקון	352350
שקופית תרבות 8 בארות	מעיל ביולוגי	354632	עם יישום אחיד של Poly-D-Lysine
מדיום נוירובזאלי	Thermo Fisher Scientific, Gibco	21103-049	מכיל 1% גלוטמקס ו-1% פניצילין-סטרפטומיצין
תוסף B-27, ללא סרום	Thermo Fisher Scientific, Gibco	17504-044	פתרון חוץ-תאי
גלוטמקס	Thermo Fisher Scientific, Gibco	35050-061
פניצילין-סטרפטומיצין	Thermo Fisher Scientific, Gibco	15140-122
פולי-D-ליזין הידרוברומיד	סיגמא-אולדריץ'	P6407-5MG
למינין	Thermo Fisher Scientific, Invitrogen	23017-015
אדנוזין 3', מונופוספט 5'-מחזורי, N6,O2'-דיבוטיריל-, מלח נתרן	Merck Millipore Corporation, Calbiochem	28745
10% סרום עיזים רגיל	תרמו פישר סיינטיפיק	16210072
טריטון-X-100	Daejung כימית ומתכת ושות	8566-4405
אנטי β III טובולין (Tuj-1)	חברת Promega	G7121	נוגדן חד שבטי עכבר
נוגדן משני מסוג IgG (H+L) נגד עכבר עיזים	Thermo Fisher Scientific, Invitrogen	A11005
המציטומטר	מרינפלד-סופיריור	לא ישים
אינקובטור CO2 בתרבית תאים	פנסוניק	לא ישים
צנטריפוגה שולחנית	סורבאל	לא ישים
מיקרוסקופ קונפוקלי	אולימפוס אמריקה בע"מ	IX71
FBS (סרום בקר עוברי)	VWR הבינלאומי, Hyclone	SH30919.03