כל ההליכים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הביקורת הווטרינרית JoVE.
1. תא מיקרופלואידי או הכנת MFC
- יציקת PDMS בתבניות ראשוניות (איור 1)
- רכשו או צרו תבניות ראשוניות (ופלים) בהתאם לפרוטוקול מפורט.
- השתמש באוויר בלחץ כדי להסיר כל סוג של לכלוך מפלטפורמת רקיק לפני שתמשיך לשלב הציפוי. פני השטח של ופלים צריך להיראות חלק וברור.
- מלא מיכל עם 50 מ"ל של חנקן נוזלי. הכינו מזרק 10 מ"ל ומחט 23 גרם.
הערה: כל ההליכים משלב זה ואילך חייבים להתבצע במכסה מנוע כימי.
- במכסה המנוע הכימי, השתמש במזרק ובמחט כדי לאגור 2 מ"ל של חנקן נוזלי. אף על פי שזה עשוי להיראות כאילו האוויר נשאב, המזרק מלא בחנקן (איור 1A). הניחו את הצלחת המכילה רקיק במיכל הניתן לאטימה.
- יש להבריג בקבוק כלורוטרימתילסילן, לנקב את פקק הגומי באמצעות מזרק מלא חנקן ולהזריק את כל תכולת המזרק לתוך הבקבוק. מבלי לשלוף את המחט, להפוך את הבקבוק ולמשוך בחזרה 2 מ"ל של chlorotrimethylsilane.
הערה: בגלל לחץ המזרק, כמות קטנה של chlorotrimethylsilane מרוססת מתוך המחט. כדי למנוע סכנה, כוונו את המחט לכיוון הדופן הפנימית של מכסה המנוע (איור 1B).
- יש לפזר כלורוטרימתילסילן באופן אחיד במיכל (משלב 1.1.4), אך לא ישירות על הפרוסות או הצלחת המכילה רקיק. סגור את המיכל ודגר במשך 5 דקות לכל רקיק.
הערה: אם זו הפעם הראשונה שהרקיק מצופה בכלורוטרימתילסילן, יש לאפשר דגירה של שעה לכל רקיק.
- אין להוציא את הפרוסות והמיכל ממכסה המנוע הכימי למשך 30 דקות.
זהירות: Chlorotrimethylsilane הוא נדיף מאוד.
- שקלו את בסיס PDMS (ראו טבלת חומרים) בצינור של 50 מ"ל והוסיפו את חומר הריפוי PDMS ביחס של 16:1, בהתאמה (למשל, 47.05 גרם בסיס ו-2.95 גרם חומר ריפוי). ערבבו במשך 10 דקות באמצעות מסובב במהירות נמוכה.
- שפכו PDMS לכל צלחת המכילה רקיק לגובה הרצוי (איור 1C).
הערה: שימוש בתאים מיקרופלואידים דקים (עד 3-4 מ"מ) משפר את ההיצמדות לצלחת התרבית ומונע דליפה.
- הניחו את כל הצלחות יחד בתוך מייבש ואקום למשך שעתיים (איור 1E). תהליך זה מסיר את האוויר הכלוא בתוך PDMS, ובכך מסלק בועות אוויר ויוצר תבנית ברורה ואחידה.
- הכניסו את הצלחות לתנור למשך 3 שעות (או לילה) בטמפרטורה של 70°C (איור 1E).
הערה: הצלחות צריכות להיות מפולסות כאשר הן מונחות בתנור.
- יציקת PDMS בתבניות אפוקסי
הערה: מכיוון שהכנת רקיקים יקרה, דורשת ציוד מיוחד ועלולה לפגוע בפלים השבירים, ניתן לייצר העתקים אפוקסיים של ופלים. ההעתקים זולים יותר, עמידים יותר, וניתן להשתמש בהם לייצור המוני של תאים מיקרופלואידים.
- יצוקו וריפאו PDMS (כמתואר ב-1.1.8-1.1.11) לתוך הפרוסת המקורית.
- הסר וחתך חלקים עודפים של PDMS והשאיר רק את האלמנטים המיקרופלואידים ואת האזור התפקודי הדרוש לעיבודם לתאים מיקרופלואידים.
- עטפו מיד את ה-PDMS בסרט דבק עבה ודביק כדי למנוע ממנו לצבור אבק.
- בחרו צלחת פלסטיק ברמת תרבית רקמה שמתאימה לכל PDMS בתוכה והשאירו מקום לאפוקסי סביבה. המרחק מה- PDMS לצלחת הפלסטיק צריך להיות פחות מ -5 מ"מ.
- הכינו כמות קטנה של PDMS מעורבב ביחס של 10:1 (בסיס: חומר ריפוי). PDMS נוזלי טרי ישמש כדי להדביק את PDMS מוצק על החלק התחתון של צלחת פלסטיק.
- יש למרוח כמות מינימלית של PDMS נוזלי על החלק התחתון המרכזי של צלחת הפלסטיק ולאחר מכן להסיר את הסרט הדביק מה-PDMS ולהדביק אותו לתחתית צלחת הפלסטיק. ודא כי אלמנטים microfluidic פונים כלפי מעלה.
- תן PDMS לרפא במשך 30 דקות בתנור 70 מעלות צלזיוס.
- מכינים את שרף האפוקסי על ידי ערבוב הבסיס וחומר הריפוי ביחס של 100:45, בהתאמה במבחנה. שרפים אפוקסי שונים עשויים להיות בעלי יחסי ערבוב שונים. הנפח הנדרש לצלחת רגילה של 100 מ"מ הוא כ-40 מ"ל.
- תנו לאפוקסי להתערבב היטב במשך 10 דקות במסובב עד שהתערובת הופכת הומוגנית באופן נראה לעין (כלומר, אין ממצאים דמויי סיבים נראים לעין בנוזל).
- צנטריפוגו את תערובת האפוקסי ב 400 x גרם במשך 5 דקות כדי להסיר בועות אוויר לכודים בפנים.
- במהלך הצנטריפוגה, מורחים שכבה דקה של שומן סיליקון סביב הקירות וכל שאר חלקי הפלסטיק החשופים של צלחת התרבית. זה ימנע מהאפוקסי להתפלמר עם פלסטיק הכלים ויאפשר להסיר את האפוקסי הנרפא בקלות בסוף הפרוטוקול.
- יוצקים את האפוקסי באיטיות לתוך הכלי עד שהוא מכסה לחלוטין את ה-PDMS ועובר אותו ב-5 מ"מ לפחות. מנעו היווצרות בועות בתוך האפוקסי על ידי שמירה על מרחק אפס בין הצינור לצלחת. הניחו את הצלחת במקום בטוח כדי שלא יזזו אותה במשך 48 השעות הבאות.
- לאחר 48 שעות אפוקסי צריך להיות נרפא לחלוטין. מכניסים את הצלחת לתנור שחומם מראש ל-80 מעלות למשך 3 שעות לריפוי סופי.
- הסר את האפוקסי שנרפא מהצלחת ואת תבנית PDMS המקורית על ידי משיכת דופן הפלסטיק של הצלחת בעדינות עד שהיא נשברת. לאחר מכן הוא אמור להיפרד בקלות מהאפוקסי ולקלף.
- לאחר החילוץ, נגבו את יתרת השומן מהעתק האפוקסי החדש והכניסו אותו הפוך (כלומר, כאשר היסודות המיקרופלואידים המשוכפלים פונים כלפי מעלה) לתוך צלחת תרבית חדשה. העתק האפוקסי מוכן כעת ליציקת PDMS.
- יש להשתמש באוויר בלחץ או N2 כדי לפוצץ שאריות PDMS או לכלוך מעובש האפוקסי ולשטוף אותו פי 2 עם איזופרופנול. ממלאים אותו בפעם השלישית ודגרים במשך 10 דקות על צלחת שייקר מסלולית. שוטפים את התבנית שוב 3x עם איזופרופנול ומשליכים את הנוזלים שנותרו. יש לייבש באוויר או N2 או להכניס לתנור בטמפרטורה של 70°C עד לייבוש.
הערה: בצע את נהלי הבטיחות בעת עבודה עם והשלכת isopropanol.
- שומרים את לוחות התבנית סגורים עד ליציקה. בצע את השלבים 1.1.8.-1.1.11.
- ניקוב ופיסול PDMS לתוך MFC (איור 2)
- גזור והסר את תבנית PDMS מהצלחת על ידי ביצוע הסימנים (+) על פרוסות באמצעות אזמל. אל תשתמשו בכוח, כיוון שהתבניות שבירות (איור 2A).
- עקבו אחר ההוראות שצוירו על השרטוט כדי לנקב ולחתוך את התאים בהתאם למערך הניסוי (איור 2B-F).
- עבור תרבית חציל חוט השדרה (איור 2C, E), ניקבו שתי בארות בקוטר 7 מ"מ בצד הדיסטלי של ה-MFC הגדול. אתר את הבארות באופן שיחפוף את שולי הערוץ. בצד הפרוקסימלי, אגרוף אחד 7 מ"מ היטב באמצע התעלה, עם חפיפה מינימלית, כך יישאר מספיק מקום עבור explants. נקבו שני חורים נוספים בקוטר 1 מ"מ בשני הקצוות של התעלה הפרוקסימלית. סובב את MFC עם אלמנטים microfluidic פונה כלפי מעלה, ובאמצעות מחט 20 G, לחצוב שלוש מערות explant קטן על באר 7 מ"מ מנוקב.
- עבור תרבית MN מנותקת (איור 2D, F), נקבו ארבע בארות בקוטר 6 מ"מ בשולי שתי התעלות של MFC קטן.
- עיקור MFC לשימוש בתרבית רקמות
- מורחים על הספסל רצועות סרט דביק באורך 50 ס"מ. לחץ ומשוך לאחור את התא כך שיפנה לסרט הדביק (הן בפנים העליונות והן בפנים התחתונות) והסר לכלוך גס. מניחים את התאים הנקיים בצלחת חדשה בקוטר 15 ס"מ.
הערה: אין ללחוץ ישירות על האלמנטים המיקרופלואידים כאשר אלה פונים כלפי מעלה.
- לדגור את התאים באתנול 70% ברמה אנליטית במשך 10 דקות על שייקר מסלולי.
- יש להשליך את האתנול ולייבש את התאים בתרבית רקמה או בתנור בטמפרטורה של 70°C.
- הנחת MFC על צלחת תחתית זכוכית
- הניחו את התא במרכז צלחת תחתית זכוכית בגודל 35 מ"מ/50 מ"מ בדרגת תרבית רקמה והפעילו כוח קל על הקצוות כדי לגרום ל-PDMS ולתחתית הצלחת להיקשר. כדי למנוע שבירת תחתית הזכוכית, הפעילו תמיד כוח על גבי משטח מוצק.
- דוגרים במשך 10 דקות ב-70°C. לוחצים על התאים כדי לחזק את ההיצמדות לצלחת.
- יש לדגור תחת אור UV למשך 10 דקות.
- ציפוי וטיפוח
- הוסף 1.5 ננוגרם/מ"ל פולי-L-אורניתין (אש"ף) לשני התאים. ודא שאש"ף רץ בערוצים על ידי פיפטציה של אמצעי הציפוי כמה פעמים ישירות בכניסה לערוץ.
- בדוק את התא המיקרופלואידי תחת מיקרוסקופ אור עם הגדלה פי 10 כדי לבדוק נוכחות של בועות אוויר. אם בועות אוויר חוסמות את המיקרו-חריצים, הניחו את ה-MFC במייבש ואקום למשך 2 דקות. בהמשך, הסירו את עודפי האוויר שנלכדו בתעלות על ידי הזרמת אמצעי הציפוי דרכן. לדגור למשך הלילה.
- החלף את אש"ף בלמינין (3 מיקרוגרם/מ"ל ב-DDW) לדגירת לילה באותו אופן.
- לפני הציפוי, לשטוף את הלמינין עם מדיום תרבית עצבית.
2. ציפוי תרבית עצבית
- תרבית עציץ חוט השדרה
- בעזרת מספריים ישרים ומלקחיים עדינים, נתחו חוט שדרה מתוך עובר עכבר E12.5 ICR-HB9:GFP. עבוד בתמיסת HBSS 1X עם 1% פניצילין-סטרפטומיצין (P/S) (איור 3A-C).
- בעזרת מספריים מיקרודיסקציה, הסירו את קרומי המוח ואת הקרניים הגביות (איור 3D).
- חתכו את חוט השדרה למקטעים רוחביים בעובי 1 מ"מ (איור 3E). יש להשליך את כל המדיום מהתא הפרוקסימלי של MFC.
- להרים explant חוט השדרה יחיד עם פיפטה בנפח כולל של 4 μL. להזריק את explant קרוב ככל האפשר למערה ולשאוב כל נוזל עודף מן הבאר פרוקסימלי דרך שקעים לרוחב (1 מ"מ אגרופים). יש לשאוב את הצמחים לתוך התעלה הפרוקסימלית.
- הוסף באיטיות 150 μL של מדיום explant חוט השדרה (SCEX, ראה טבלת חומרים וטבלה 3) לבאר הפרוקסימלית.
- תחזוקת תרבית עציץ חוט השדרה
- הוסף מדיום SCEX בתא הפרוקסימלי ומדיום SCEX עשיר (SCEX עם 50 ng/mL של BDNF ו- GDNF) בתא הדיסטלי. שמור על שיפוע נפח של לפחות 15 μL לכל באר בין הבארות הדיסטליות (נפח גבוה יותר) לבין הבאר הפרוקסימלית.
- רענן את המדיום כל יומיים. זה יכול לקחת את האקסונים עד 3-5 ימים כדי לחצות distally.
3. הובלה אקסונלית (איור 4A)
- תיוג מיטוכונדריה ותאים חומציים
- הכינו מדיום SCEX טרי (או CNB עבור MN מנותק) המכיל 100 ננומטר Mitotracker אדום עמוק FM ו 100 ננומטר LysoTracker אדום. יש לדגור במשך 30-60 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. ניתן להשתמש בצבעים אחרים כל עוד הפלואורופורים שלהם אינם חופפים.
- יש לשטוף 3x עם מדיום CNB/SCEX חם. הלוחות מוכנים להדמיה.
- הדמיה חיה
- קבל 100 סדרות תמונות קיטועי זמן של העברה אקסונלית במרווחים של 3 שניות, עם סך של 5 דקות לכל סרט.
הערה: מערכת ההדמיה ששימשה במחקר זה כללה מיקרוסקופ הפוך המצויד בקונפוקל דיסק מסתובב, הנשלט באמצעות תוכנת הדמיה של תאים תקינים, עדשת שמן 60x, NA = 1.4, ומצלמת EMCCD. הסרטים נרכשו בסביבה מבוקרת בטמפרטורה של 37°C ו-5% CO2.
הערה: ניתן לצלם סרטים ארוכים או קצרים יותר עם קיטועי זמן, בהתאם לניסוי. אפילו סרטי לילה ניתן להקליט במידת הצורך. עם זאת, קריטי לנסות להפחית את זמן החשיפה ואת עוצמת הלייזר, כמו גם את מספר התמונות הכולל, כדי להפחית את רעילות האור וההלבנה במהלך רכישת הסרט.
